分享一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法

这里写的分享一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法,今天小编就来为大家介绍

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一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法
本发明提供了一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法。本方法在发酵产耐高温海藻糖合酶的大肠杆菌细胞表面自组装淀粉质纳米纤维生物膜,利用可基因编码的多肽标签SpyTag?SpyCatcher特异性共价结合高效固定重组β淀粉酶,自主构建海藻糖合酶—β淀粉酶双酶催化体系,最终使胞外、胞内两步催化连续进行。本方法对β淀粉酶的固定化效率可达到50%?62%;含量为20%?25%重量的可溶性淀粉在胞外经生物膜上的β?淀粉酶催化形成麦芽糖后进入细胞内与海藻糖合成酶反应生成海藻糖,固定化细胞重复利用10?16次后淀粉的转化率可达到45%?55%。

一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域,涉及采用基因工程以及酶工程的技术手段,利用大肠杆菌催化廉价的淀粉质原料高效制备海藻糖的方法。

[0002]海藻糖广泛分布于细菌、藻类、酵母、低等植物、昆虫和其他无脊椎动物中,是国际上最近开发的主要低聚糖之一。海藻糖可以在细胞处于饥饿、干燥、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等胁迫环境时,有效地维持细胞内质膜和蛋白质的稳定,在保护基因工程酶类、各种病毒、疫苗、抗体、蛋白质因子、核酸等方面取得令人振奋的结果。这一独特的生物学功能使海藻糖在食品、化妆品、分子生物学、医学、农业等领域拥有广阔的应用前景。
[0003]目前海藻糖工业化生产过程多为酶法合成,但海藻糖合酶属于胞内酶,通常需要破碎提取纯化海藻糖酶系,造成不同程度的酶活损失,且纯化操作复杂花费巨大效率低,增加了生产成本。无论是通透性含酶细胞还是海藻糖合酶与底物麦芽糖催化反应,受到酶促反应平衡的制约,底物和副产物的存在给海藻糖的纯化增加了难度。
[0004]专利CN105039191A公开了一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用,该方法将麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶与Pirlp蛋白融合展示于菌体表面,实现两种酶在毕赤酵母的表面展示,从而实现双酶法生产海藻糖的高效应用。该技术需要分步催化反应合成海藻糖,麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)对麦芽糖并不产生转化,导致麦芽糖大量积累,最终使得海藻糖的得率不能达到较高水平,造成酶利用率较低,成为双酶反应的限制因素。
[0005]专利CN103146779A公开了一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法,通过透性化处理改变细胞膜通透性利用麦芽糖全细胞催化合成海藻糖,免去细胞破碎工序。海藻糖合成酶(Trehalose synthase,简称TreS)可以直接作用于麦芽糖底物,将α,α-1,4糖苷键连接的麦芽糖通过分子内转糖苷一步转化为α,α-l,I糖苷键连接的海藻糖。该途径只需一步反应,工艺简单,但其底物麦芽糖与淀粉相比不存在竞争优势。
[0006]专利CN104328107A公开了一种共固定化双酶催化合成海藻糖的方法,该方法透性化处理含海藻糖合酶的工程菌,并通过制备壳聚糖-海藻糖酸钠微球固定细胞和糖化酶,以淀粉为原料合成海藻糖,不仅提高了催化效率和可重复利用性,而且原料廉价,但通过化学法制备固定化载体,固定化效率不高,且非完全绿色生物催化过程。
[0007]因此,采用新型、高效的方法催化合成海藻糖的方法仍有较大发展潜力。



[0008]本发明所要解决的技术问题在于解决现有合成体系中海藻糖合成的技术路线以及效率问题;即,在现有双酶催化体系(麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase)酶利用效率较低;以及单酶催化体系(海藻糖合成酶TreS)固定化效率不高,底物不具备竞争优势,以及分离成本较高的问题。
[0009]为了解决上述技术问题,本发明的技术方案为:以淀粉质原料,特别是可溶性淀粉为底物;利用可基因编码的多肽标签SpyTag-SpyCatcher特异性共价结合高效固定重组β淀粉酶,将淀粉酶固定化于大肠杆菌细胞表面;可溶性淀粉在胞外表面被催化为麦芽糖,麦芽糖进入表达了海藻糖合成酶的大肠杆菌胞内,经海藻糖合成酶催化形成海藻糖,并进一步分离纯化获得海藻糖。
[0010]具体的,本发明的技术方案为:
一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统,其特征在于,该双酶系统可在同一体系中催化淀粉生成海藻糖,其中,该双酶分别为淀粉酶与海藻糖合成酶。
[0011]本发明所述的系统至少包括,同时表达海藻糖合成酶基因Tre与CsgA基因的大肠杆菌A;表达β淀粉酶基因的大肠杆菌B;将多肽标签SpyTag连接在CsgA基因的碳端形成的融合蛋白CsgA-SpyTag;以及将多肽标签SpyCatcher连接在β淀粉酶基因的碳端形成的融合蛋白BA-SpyCatcher;以及在大肠杆菌A细胞表面由CsgA-SpyTag高度聚合自组装形成的纳米纤维生物膜共价固定BA-SpyCatcher形成的固定化催化膜。
[0012]其中,融合蛋白CsgA-SpyTag的基因序列是根据NCBI已经公布的CsgA序列(NCBIReference Sequence: NC_000913.3)和已报道文献(Nguyen P Q, Botyanszki Z, Tay PK R, et al.Programmable b1film—based materials from engineered curlinanof ibres [ J].Nature communicat1ns , 2014,5.)中 SpyTag (多肽序列AHIVMVDAYKPTK)通过6氨基酸残基GSGGSG的柔性linker融合连接而成。
[0013]融合蛋白BA-SpyCatcher基因序列是根据NCBI已经公布的β-淀粉酶BA序列(GenBank: AJ250858.1)和公布的SpyCatcher的基因序列(GenBank: JQ478411.1)通过6氨基酸残基GSGGSG的柔性linker融合连接而成,β-淀粉酶BA序列采用全基因合成方法获得。
[0014]构建所述系统的方法,具体的步骤为:
(1)构建在含海藻糖合成酶细胞表面形成纳米纤维生物膜的大肠杆菌Α:将载体PETDuet与PCR扩增的TreS基因同时双酶切连接获得重组质粒PETDuet-TreS,再将其与CsgA-SpyTag融合基因片段同时双酶切连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经氨苄抗生素筛选、菌落PCR验证以及基因测序获得基因序列正确的大肠杆菌A;
(2)构建含β-淀粉酶的工程菌B:设计引物进行PCR扩增获得淀粉酶基因片段BA和多肽标签SpyCatcher基因片段,通过重叠PCR方法进行拼接构建重组质粒PET28a-BA- SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经卡那霉素筛选、菌落PCR验证以及基因测序获得基因序列正确的大肠杆菌B
(3)自诱导培养大肠杆菌A,获得含大肠杆菌A的培养液;
(4)自诱导培养大肠杆菌B;
(5)将大肠杆菌B破碎并分离纯化获得粗酶液BA-SpyCatcher;
(6)将粗酶液与步骤(3)所述的培养液接触反应48h,获得纳米纤维生物膜固定化双酶系统;
(7)离心并清洗步骤(6)所述的纳米纤维生物膜固定化双酶系统,并用磷酸盐缓冲液重悬至原体积大小。
[0015]本发明所述的方法,其中,在步骤(6)中,粗酶液的量按制备该粗酶液的发酵液体积计,与该步骤中所用步骤(3)培养液的体积比为1:1。
[0016]本发明所述的方法,其中,还包括离心分离步骤(3)及步骤(4)所述的工程菌,并用磷酸盐缓冲液重悬的步骤。
[0017]本发明所述的方法,其中,步骤(5)中所述破碎方法为超高压破碎,分离为固液分离,筛孔小于14目;纯化方法为膜过滤,截留分子量为300-400。
[0018]—种利用纳米纤维生物膜固定化双酶催化合成海藻糖的方法,利用上述任一纤维生物膜固定化双酶系统在磷酸缓冲液体系中与可溶性淀粉接触,催化生成海藻糖。该方法的具体步骤为:
(1)将质量浓度为20%_25%的可溶性淀粉溶液与纳米纤维生物膜固定化双酶系统接触,条件为35-60 °C, pH 6.0-7.5,转速100_200rpm,催化反应20-30小时;获得含海藻糖的溶液;
(2)分离权利要求1所述的海藻糖;
其中,还包括回收纳米纤维生物膜固定化双酶系统的步骤。
[0019]对于本发明中的可溶性淀粉应理解为:利用含淀粉的原料或者纯淀粉,经过现有技术中的水热或者液化技术,将淀粉颗粒溶胀并溶于水的淀粉溶液,或者直接可溶于热水的淀粉原料,其中只要满足其干物质含量在20-25%即可。
[0020]该催化合成海藻糖的方法,其中,所述纳米纤维生物膜固定化双酶体系的体积与可溶性淀粉溶液的体积比为1: 4。
[0021]上述任一所述的磷酸缓冲液,其磷酸根浓度为0.04mol/L,pHS7.0。
[0022]通过本技术方案,实现了廉价原料可溶性淀粉高效制备海藻糖的工艺路线。
[0023]在本发明的有益效果在于:
I.本发明通过纳米纤维生物膜集成展示技术在含海藻糖合酶的大肠细胞表面提供了功能化生物膜基质作为淀粉酶固定化载体,构建了淀粉酶-海藻糖合酶双酶固定催化体系,胞内胞外两步催化连续进行,进而使酶催化反应始终向着终产物海藻糖的方向进行,进一步提高了淀粉的转化效率。
[0024]2.本发明采用的共价结合策略自发进行,无化学处理步骤,提供简单组装式方法特异性固定酶,固定化载体材料完全生物合成,结合位点密集排列产生大量表面催化区域,大大提高了酶的固定化效率以及利用效率,从而提高海藻糖生产效率。
[0025]3.本发明将全细胞催化和固定化技术相结合,反应液体系中其他成分较少,减少了后续分离纯化海藻糖的难度,大大降低了分离成本。
[0026]4.本发明中含固定化酶的细胞可反复利用10-16次,实际生产应用性强。

?0027]图1为Tres基因和CsgA-SpyTag融合基因的琼脂糖凝胶电泳条带图;
其中,Lane 1:DNA Marker 5000;
Lane 2,3:Tres基因PCR扩增产物;
Lane 4,5:CsgA_SpyTag融合基因PCR产物;
Lane 6: DNA Marker 2000 。
[0028]图2为β-Amylase-SpyCather融合基因琼脂糖凝胶电泳条带图;
其中,Lane 1:DNA Marker 5000;
Lane 2,3:β-Amylase-SpyCather融合基因PCR产物。
[0029]图3为大肠杆菌细胞表面淀粉样纤维与刚果红结合吸附后全波长扫描分析图,插图为刚果红吸附前后的颜色对比。
[0030]图4为大肠杆菌的扫描电镜图,放大倍数为10000倍(A)为表达CsgA淀粉样纤维的大肠杆菌(B)不表达CsgA淀粉样纤维的大肠杆菌。

[0031]实施例1
本实施例说明海藻糖合成酶基因TreS和淀粉样蛋白CsgA-SpyTag融合基因共表达工程菌的构建
融合蛋白CsgA-SpyTag的基因序列是根据NCBI已经公布的CsgA序列(NCBI ReferenceSequence: NC_000913.3)和已报道文献(Nguyen P Q, Botyanszki Z, Tay P K R, etal.Programmable b1film-based materials from engineered curli nanofibres[J].Nature communicat1ns, 2014, 5.)中SpyTag (多肽序列AHIVMVDAYKPTK)通过6氨基酸残基GSGGSG的柔性I inker融合连接而成。
[0032]具体的,将已构建的菌种E.coli BL21 (DE3)(pET22b-treS)(Jiang L, Lin Μ,Zhang Y, et al.1dentificat1n and characterizat1n of a novel trehalosesynthase gene derived from saline-alkali soil metagenomes[J].PloS one, 2013,8(10): e77437.)接种至LB液体培养基(蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化钠10 g/L)中37°C,200rpm过夜培养,取发酵菌液按照TAKARA细菌质粒提取试剂盒所提供的方法提取该质粒pET22b-treS,以此为模板设计引物Tl和T2并进行PCR扩增。
[0033]Tl:5 ’-GGAATTCCATATGCAGATGACCGGGGAC-3,
T2:5 ’-CCCTCGAGTCACTTCGCCGTCTG -3’
其中在引物TI和T2中分别添加Nde I和Xho I酶切位点(划线部位)。
[0034]PCR 条件为:94°C 预变性 5 min ;94°C 变性 30 s,60°C 退火 30 s,72°C 延伸 Imin50s,循环30次;72°C补充延伸10 min0l%的琼脂糖凝胶电泳检测产物并割胶回收1803bp左右条带(如图1),获得TreS基因片段。将其与载体PETDuet同时经NdeI和XhoI双酶切并连接获得重组质粒PETDuet-TreS,转化至大肠杆菌感受态E.coli BL21 (DE3)中,经Amp抗性、菌落PCR筛选并测序获得序列正确的重组质粒PETDuet-TreS。
[0035]通过全合成获得CsgA-SpyTag融合基因。以全合成CsgA-SpyTag基因的穿刺菌质粒为模板,设计合成上下游引物Cl和C2,
Cl:5 ’-CATGCCATGGATGAAACTTTTAAAAGTA -3,
C2:5 ’-CCCAAGCTTTTATTTGGTGGGTTTAT -3’
其中在引物Cl和C2中分别添加Nco I和Hind ΠΙ酶切位点(划线部位)
PCR扩增条件为:94°C预变性5 min ;94°C变性30 s,60°C退火30 s,72°C延伸40 S,循环30次;72°C补充延伸10 Hiin01%的琼脂糖凝胶电泳检测产物并割胶回收525bp左右条带,获得CsgA-SpyTag基因PCR扩增胶回收片段,琼脂糖凝胶电泳条带验证如图1所示。
[0036]将质粒PETDuet-TreS与CsgA-SpyTag融合基因PCR胶回收片段使用快切酶Nco I和Hind ΠΙ同时双酶切后16 0C过夜连接,获得异源表达载体PETDuet-TreS-CsgA-SpyTag,将重组质粒转化到表达宿主大肠杆菌感受态E.coli BL21(DE3)中,经Amp抗性,菌落PCR筛选重组子得到克隆菌株E.coli BL21(DE3)(PETDuet-TreS-CsgA-SpyTag),经测序正确后保存。
[0037]实施例2
本实施例说明淀粉酶-SpyCatcher融合基因BA-SC表达工程菌的构建。
[0038]融合蛋白BA-SpyCatcher基因序列是根据NCBI已经公布的β-淀粉酶BA序列(GenBank: AJ250858.1)和公布的SpyCatcher的基因序列(GenBank: JQ478411.1)通过6氨基酸残基GSGGSG的柔性linker融合连接而成,β-淀粉酶BA序列采用全基因合成方法获得。
[0039]根据β_淀粉酶基因序列和SpyCatcher基因序列设计合成上下游引物Fl和Rl (扩增淀粉酶基因BA)、F2和R2 (扩增多肽标签Spy Cat cher )。
[0040]F1:5 ’-CGGGATCCATGTTCATTTTGAGTC-3’
Rl:5 ’-ACTGCCACCGCCACCGCTACCGCCACCGCCCCAATTATCTGTATAA-3 ’
F2:5 ’-ACTGCCACCGCCACCGCTACCGCCACCGCCCCAATTATCTGTATAA-3’
R2:5 ’-CCCTCGAGTTAAATATGAGCGTCACCTTTAGTT-3’
其中在引物Fl和R2中分别添加BamH I和Xho I酶切位点(划线部位)
以全合成的β-淀粉酶基因片段为模板进行PCR扩增。PCR条件为:94°C预变性5 min ;94°C变性30 s,60°C退火30 s,72°C延伸2 min,循环30次;72°C补充延伸10 min0l%的琼脂糖凝胶电泳检测产物并割胶回收1600bp左右条带,获得BA-1inker基因片段。
[0041 ]以合成的SpyCatcher基因为模板,以F2和R2为引物,进行PCR扩增。PCR条件为:94°C预变性5 min ;94°C变性30 s,55°C退火30 s,72°C延伸0.5min,循环30次;72°C补充延伸10 min0l%的琼脂糖凝胶电泳检测产物并割胶回收450bp左右条带,获得SpyCatcher-1inker基因片段。
[0042]将BA-1 inker基因片段和SpyCatcher-1 inker基因片段通过重叠PCR方法进行拼接。
[0043]PCR条件为:94°C预变性5 min ;94°C变性30 s,55°C退火30 s,72°C延伸 2min,循环30次;72°C补充延伸10 Hiin01%的琼脂糖凝胶电泳检测产物并割胶回收2000bp左右条带的BA-1inker- SpyCatcher基因片段(如图2所示),将该融合目的基因与表达载体pET-28a同时经BamH I和Xho I双酶切并连接获得重组质粒PET28a_BA_ SC,转化至大肠杆菌感受态E.coli BL21(DE3)中,经kana抗性、菌落PCR筛选重组子得到克隆菌株E.coli BL21(DE3)(PET28a-BA- SC),经测序后保存。
[0044]实施例3
本实施例说明在含海藻糖合成酶细胞表面创造功能性纳米纤维生物膜的效果从平板将菌种E.coli BL21(DE3)(PETDuet -TreS-CsgA-ST)接种到含有氨苄抗性的50ml LB培养基中,37°C,200rpm/min过夜培养12h;按2%的接种量将菌液转接至含氨苄抗性的50 mL 自诱导培养基中(甘油 5g/L、Na2HP04 6g/L、K2HP04 3g/L、NH4Cl lg/L、NaCl
0.5g/L、MgS04-7H20 0.5g/L、大豆蛋白胨lOg/L),30°C,180r/min振荡培养诱导表达 10-12h,收集发酵液,使用pH 7.0 PBS缓冲液洗涤2次并重悬,测定海藻糖合酶细胞的酶活为8000U/mL。将含海藻糖合酶的大肠杆菌通过刚果红溶液结合吸附可观察到菌体细胞表面明显吸附了刚果红,同时将可产生CsgA淀粉样纤维的大肠杆菌通过扫描电镜分析(电镜扫描图请参见附图4),表明大肠杆菌表面产生了纳米纤维生物膜,实现了海藻糖合酶TreS和淀粉样蛋白CsgA的共表达,可以作为特异性固定化载体。
[0045]海藻糖合酶酶活定义:在30°C,每Imin生成I nmoL海藻糖所需的海藻糖合酶的量为I个酶活力单位。
[0046]酶活测定:取800ul PBS缓冲液配制的麦芽糖溶液与200ul细胞悬浮液混匀(每组3个平行),lml反应体系在30°C,反应30min,沸煮10 min灭酶。待其冷却后,12000 r/min离心
2min,取上清液,测定生成的海藻糖含量。待其冷却后用HPLC根据标准曲线测定海藻糖含量并计算海藻糖合酶酶活。
[0047]HPLC测定方法为:示差折光检测器,色谱柱为Alltima Amino 100A 5u柱(4.6mmX 250mm);流动相:乙腈/水=75/25(v/v);柱温:35度;进样量10ul;流速:0.6mL/min;
定量刚果红结合吸附分析:取I mL PBS重悬的诱导表达CsgA的菌体细胞,添加
0.025mmol刚果红溶液,混合振荡1min,12000rpm离心lmin,在490nm下用酶标仪测其上清吸光度,以不表达CsgA的普通菌体细胞为对照,扫描结果以及图片请参见附图3,由扫描结果可知表达CsgA蛋白的菌体细胞表面明显吸附了刚果红。
[0048]实施例4
本实施例说明利用纳米纤维生物膜固定淀粉酶用于双酶催化合成海藻糖的效果。
[0049]将构建的菌种Ε.coli BL21(DE3)(PET28a-BA- SC)接种至50ml LB液体培养基中,37度过夜培养,按2%接种量转接LB培养基中,37度振荡培养2.5h,添加终浓度0.2mmol/L的IPTG,25°C 180r/min继续培养10h,离心收集菌体,使用pH 7.0 PBS缓冲液洗涤2次并1/2体积重悬,采用超高压力破碎进行细胞破碎获得β-淀粉酶酶液。取0.9 mL用PBS缓冲液(pH7.0)配制的浓度2%(胃八)可溶性淀粉溶液,40°C预热5 min,加入0.1 mL粗酶液后40°C保温反应30 min,沸水浴加热5 min,离心取上清进行0.22 μπι滤膜过滤,过滤后的上清液进行高效液相色谱法(HPLC)检测麦芽糖浓度并计算酶活。测定β淀粉酶酶活25 U/mLo
[0050]酶活力定义为:在上述条件下,Iml酶液每分钟催化2%可溶性淀粉生成Ιμπιο?麦芽糖的酶量为I个酶活力单位(U)。
[0051]将表面展示纳米纤维生物膜的大肠杆菌细胞悬浮液与β-淀粉酶酶液按照等体积比例混合振荡过夜,离心弃残余酶液,并以考马斯亮蓝法检测残液中未吸附固定的淀粉酶含量,以磷酸盐缓冲液清洗菌体细胞两次并1/4体积重悬,获得表面固定β_淀粉酶的大肠杆菌,经测定淀粉酶在纳米纤维生物膜上的固定化效率可达到50%-62%。
[0052]向5L反应器中加入2L质量浓度为20%-25%的可溶性淀粉溶液和500mL表面固定β-淀粉酶的大肠杆菌细胞悬浮液低速搅拌反应,催化反应20-30小时,反应条件为35-60 0C,pH 6.0-7.5,转速100-200rpm;采用14目筛孔压滤机过滤分离反应液,滤液为海藻糖混合液,滤渣为双酶固定的大肠杆菌,采用HPLC检测其海藻糖含量,并计算海藻糖的转化率,以此评价细胞的催化活性,经试验在此条件下转化可溶性淀粉溶液为海藻糖的初次转化率可达 55%。
[0053]实施例5
本实施例说明工程化生物膜固定双酶催化系统的重复利用情况将表面固定β_淀粉酶的大肠杆菌重悬液与质量浓度为20%-25%的可溶性淀粉溶液按照体积比1: 4混合。即5L反应器中加入2L质量浓度为20%-25%的可溶性淀粉溶液和500mL表面固定淀粉酶的大肠杆菌细胞悬浮液低速搅拌反应,催化反应24小时,反应条件为40°C,pH 7.0,转速10rpm;采用14目筛孔压滤机过滤分离反应液,滤液为海藻糖混合液,采用HPLC检测其海藻糖含量,并计算海藻糖的转化率,滤渣为双酶固定的大肠杆菌,用PBS缓冲液重悬后重复利用,生物膜固定双酶催化系统重复利用10次后转化率为50%,重复利用16次后转化率为45%。以上结果可以看出,利用纳米纤维生物膜表面展示β-淀粉酶的含海藻糖合酶大肠杆菌为全细胞双酶催化系统转化可溶性淀粉溶液可以循环利用,每次转化后会有酶活损失,但是重复利用10_16次后转化率在45%以上。

1.一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统,其特征在于,该双酶系统可在同一体系中催化淀粉生成海藻糖,其中,该双酶分别为β-淀粉酶与海藻糖合成酶。2.根据权利I所述的系统,其特征在于,该系统至少包括,同时表达海藻糖合成酶基因Tre与CsgA基因的大肠杆菌A;表达β淀粉酶基因的大肠杆菌B;将多肽标签SpyTag连接在CsgA基因的碳端形成的融合蛋白CsgA-SpyTag;以及将多肽标签SpyCatcher连接在β淀粉酶基因的碳端形成的融合蛋白BA-SpyCatcher ;以及在大肠杆菌A细胞表面由CsgA-SpyTag高度聚合自组装形成的纳米纤维生物膜共价固定BA-SpyCatcher形成的固定化催化膜。3.构建权利要求1所述系统的方法,其特征在于,该方法具体的步骤为: (1)构建在含海藻糖合成酶细胞表面形成纳米纤维生物膜的大肠杆菌A:将载体PETDuet与PCR扩增的TreS基因片段同时双酶切后连接获得重组质粒PETDuet-TreS,再将其与CsgA-SpyTag融合基因片段同时双酶切连接后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经氨苄抗生素筛选、菌落PCR验证以及基因测序获得基因序列正确的大肠杆菌Α; (2)构建含β-淀粉酶的大肠杆菌B:设计引物进行PCR扩增获得淀粉酶基因片段BA和多肽标签SpyCatcher基因片段,通过重叠PCR方法进行拼接构建重组质粒PET28a-BA- SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经卡那霉素抗性筛选、菌落PCR验证以及基因测序获得基因序列正确的大肠杆菌B (3)自诱导培养大肠杆菌A,获得含大肠杆菌A的培养液; (4)自诱导培养大肠杆菌B; (5)将大肠杆菌B破碎并分离纯化获得粗酶液BA-SpyCatcher; (6)将粗酶液与步骤(3)所述的培养液接触反应48h,获得纳米纤维生物膜固定化双酶系统; (7)离心并清洗步骤(6)所述的纳米纤维生物膜固定化双酶系统,并用磷酸盐缓冲液重悬至原体积大小。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(6)中,粗酶液的量按制备该粗酶液的发酵液体积计,与该步骤中所用步骤(3)培养液的体积比为1:1。5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,还包括离心分离步骤(3)及步骤(4)所述的工程菌,并用磷酸盐缓冲液重悬的步骤。6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(5)中所述破碎方法为超高压破碎,分离为固液分离,筛孔小于14目;纯化方法为膜过滤,截留分子量为300-400。7.—种利用纳米纤维生物膜固定化双酶催化合成海藻糖的方法,其特征在于,利用上述任一权利要求所述的系统在磷酸缓冲液体系中与可溶性淀粉接触,催化生成海藻糖。8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,该方法的具体步骤为: (1)将质量浓度为20%-25%的可溶性淀粉溶液与纳米纤维生物膜固定化双酶系统接触,条件为35-60 °C, pH 6.0-7.5,转速100_200rpm,催化反应20-30小时;获得含海藻糖的溶液; (2)分离权利要求1所述的海藻糖; 其中,还包括回收纳米纤维生物膜固定化双酶系统的步骤。9.按照权利要求8所述的方法,其特征在于,所述纳米纤维生物膜固定化双酶体系的体积与可溶性淀粉溶液的体积比为1: 4。10.上述任一权利要求所述的磷酸缓冲液,其特征在于,其磷酸根浓度为0.04 mol/L,pH为7.0。
C12R1/19GK105838704SQ201610320569
2016年8月10日
2016年5月16日
江凌, 宋小刚, 黄和, 唐苏苏
南京工业大学

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