推荐一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法与流程

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本发明实施例涉及纳米科学技术及生物医药领域,具体涉及一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法。



背景技术:

磁性微球用于核酸提取是其在生物医学领域重要运用领域之一,任何与核酸有关的科学或医学研究都离不开核酸的提取,而且核酸提取的效率和效果直接影响后续的研究或医疗诊断。尤其是磁性微球用于dna的检测,是体外诊断和治疗疾病的基础,具有高选择性,高灵敏度,快速,方便的特点。磁性微球对于简化检测程序,提高检测结果的准确度,降低检测下限,以及实现检测工作的自动化操作等方面都具有广泛的应用前景。

随着分子生物学技术发展的日新月异,在很多的领域需要对及其痕量核酸进行检测,比如法医检测、转基因检测、液体活检中的游离核酸检测、病毒检测等,尤其是临床样本往往病毒含量较低,病毒核酸提取效率的高低将直接影响到实验的阳性检出率,因此对磁性微球提出了更高的要求,对此,现有技术中磁性微球的制作工艺还无法满足。



技术实现要素:

为此,本发明实施例提供一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,通过采用超声辅助水相共沉淀方法制备fe3o4磁性微球,以柠檬酸根修饰fe3o4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚,然后在fe3o4磁性微球表面用sio2包被修饰,制备出具有较强磁响应性的fe3o4/sio2亚微米微球,该磁性微球具有优良的生物相容性、亲水性以及非常好的化学稳定性和胶体稳定性,主要适用于痕量核酸的分离纯化,以解决现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的,本发明实施例提供如下技术方案:一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,包括以下制作步骤:

s1、fe3o4磁性微球的制备及筛选:铁盐在碱性环境中,采用超声辅助水相共沉淀方法合成fe3o4,以柠檬酸根修饰fe3o4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚;与普通机械搅拌相比,超声不仅加快了纳米粒的生成,而且显著提高了纳米粒的单分散性;

s2、fe3o4磁性微球的表面包被修饰:在fe3o4磁性微球表面用sio2包被修饰。

进一步地,步骤s1中,fe3o4磁性微球的制备及筛选步骤具体包括:

s1.1、分别配置0.1-1mol的fe3+水溶液与fe2+水溶液,按照fe3+与fe2+物质的量的比为2:1混合置于三口瓶中;

s1.2、上述混合液搅拌均匀后,通入氮气除氧30min,向混合液中加入碱溶液调整ph值为10-12,同时开启超声并剧烈搅拌0.5小时,加入0.1-2mol柠檬酸钠溶液至体系,继续超声搅拌0.5小时,停止超声用水浴锅加热至90℃反应2小时,期间继续机械搅拌并通入氮气;

s1.3、反应结束,冷却至室温后,反应产物磁分离,用去离子水反复洗涤至中性,然后超声分散,得到具有良好亲水分散性的fe3o4磁性微球。

进一步地,步骤s1.2中,通过梯度设置转速和溶液中柠檬酸根的浓度,合成多组fe3o4磁性微球。

进一步地,进行fe3o4磁性微球合成时,搅拌速度分别设置为500r/min、700r/min、900r/min共三个梯度的转速。

进一步地,在三个转速条件下,溶液中柠檬酸根的浓度设置为0.01mol、0.02mol、0.03mol、0.04mol、0.05mol、0.06mol、0.07mol、0.08mol、0.09mol、0.1mol共十种,一共合成了30个组合的fe3o4磁性微球,调整其固含量为50mg/ml,然后对这30个组合的fe3o4磁性微球,进行筛选。

进一步地,步骤s1.3中,对于步骤s1.2中合成的多组fe3o4磁性微球根据磁响应强度、粒径大小、悬浮性三个方面进行筛选;

1、磁响应强度:分别吸取1.5mlfe3o4磁性微球置于1.5ml离心管,放置于磁力架上,记录磁吸时间;

2、粒径大小:用粒度仪测试,平均粒径为500nm左右;

3、悬浮性:分别吸取1.5ml1.5mlfe3o4磁性微球置于1.5ml离心管,混合2min,自然沉降,记录液面沉到离心管0.5ml处时间。

最后筛选出搅拌速度为700r/min、柠檬酸根的浓度为0.05mol时合成的fe3o4磁性微球综合表现最好,然后在其进行表面的包被修饰。

进一步地,步骤s2中fe3o4磁性微球的表面包被修饰的具体步骤包括:

s2.1、取10-100gfe3o4磁性微球,用无水乙醇清洗三次遍,分散到80%的无水乙醇中,移入三颈烧瓶中,室温下以100r/min-500r/min速度搅拌;

s2.2、加入质量浓度为25%氨水,将ph值调节为1l,开启超声,滴加经过重蒸处理过的正硅酸四乙酯的溶液,滴加完毕后超声反应2h~12h;

s2.3、反应结束后用无水乙醇清洗两遍,再用1mol的稀盐酸清洗2次,然后用去离子水洗涤至中性,得到fe3o4/sio2复合磁性微球,将上述方法制得的fe3o4/sio2复合磁性微球经超声分散处理1h后,用纳米激光粒度仪测得其二次粒径为600nm~1μm,饱和磁化强度为45.0-70emu/g。

进一步地,步骤s2.2中,正硅酸四乙酯溶液滴加量为2-200ml,滴加速度为每分钟2ml。

本发明实施例具有如下优点:

本发明采用超声辅助水相共沉淀方法制备fe3o4磁性微球,以柠檬酸根修饰fe3o4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚,与普通机械搅拌相比,超声不仅加快了纳米粒的生成,而且显著提高了纳米粒的单分散性;

通过梯度设置转速和溶液中柠檬酸根的浓度,合成了30个组合的fe3o4磁性微球,然后在这些组合中选出最优组合,最后进行包被筛选后,能够得到具有良好亲水分散性的fe3o4磁性微球;

在fe3o4磁性微球表面用sio2包被修饰,sio2表面存在丰富的硅羟基,能很大程度地降低粒子的零电点和屏蔽磁偶极子的互相作用,磁性微球具有优良的生物相容性、亲水性以及非常好的化学稳定性和胶体稳定性,可使复合粒子容易进一步生物功能化,能够有效吸附核酸,尤其在样本量少或者痕量核酸(血迹、血斑、血清游离、唾液、细菌、病毒等)的样本进行提取与纯化;

本发明制备的磁性微球应用于痕量核酸(血迹、血斑、血清游离、唾液、细菌、病毒等)的提取。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是示例性的,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等,均仅用以配合说明书所揭示的内容,以供熟悉此技术的人士了解与阅读,并非用以限定本发明可实施的限定条件,故不具技术上的实质意义,任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整,在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下,均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明提供的实施例3所制备的磁性微球应用到人血斑dna提取的样本基因组电泳检测图;

图2为本发明提供的实施例4所制备的磁性微球应用到人血斑dna提取的样本基因组电泳检测图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

实施例1

该实施例的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,包括以下制作步骤:

s1、fe3o4磁性微球的制备及筛选:铁盐在碱性环境中,采用超声辅助水相共沉淀方法合成fe3o4,以柠檬酸根修饰fe3o4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚;

具体包括:

s1.1、称取32.5gfecl3与12.7gfecl2溶于100ml超纯水中混合均匀,转移到三口瓶中;

s1.2、上述混合液搅拌均匀后,通入氮气除氧30min,向混合液中加入碱溶液调整ph值为10-12,同时开启超声并剧烈搅拌0.5小时,转速700r/min,加入1.47g柠檬酸三钠溶液至体系,继续超声搅拌0.5小时,停止超声用水浴锅加热至90℃反应2小时,期间继续机械搅拌并通入氮气;

s1.3、反应结束,冷却至室温后,反应产物磁分离,用去离子水反复洗涤至中性,然后超声分散,得到具有良好亲水分散性的fe3o4磁性微球;

s2、fe3o4磁性微球的表面包被修饰:在fe3o4磁性微球表面用sio2包被修饰;

具体步骤包括:

s2.1、取10gfe3o4磁性微球,用无水乙醇清洗三次遍,分散到100ml80%的无水乙醇中,移入三颈烧瓶中,室温下以100r/min-500r/min速度搅拌;

s2.2、加入质量浓度为25%氨水,将ph值调节为1l,开启超声,滴加经过重蒸处理过的正硅酸四乙酯的溶液20ml,控制滴加速度为每分钟2ml,滴加完毕后超声反应6h;

s2.3、反应结束后用无水乙醇清洗两遍,再用1mol的稀盐酸清洗2次,然后用去离子水洗涤至中性,得到fe3o4/sio2复合磁性微球。

实施例2:

该实施例的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,包括以下制作步骤:

s1、fe3o4磁性微球的制备及筛选:铁盐在碱性环境中,采用超声辅助水相共沉淀方法合成fe3o4,以柠檬酸根修饰fe3o4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚;

具体包括:

s1.1、称取270.3gfecl3·6h2o与139gfeso4·7h2o溶于1l超纯水中混合均匀,转移到三口瓶中;

s1.2、上述混合液搅拌均匀后,通入氮气除氧30min,向混合液中加入氨水溶液调整ph值为10-12,同时开启超声并剧烈搅拌0.5小时,转速700r/min,加入14.7g柠檬酸三钠溶液至体系,继续超声搅拌0.5小时,停止超声用水浴锅加热至90℃反应2小时,期间继续机械搅拌并通入氮气;

s1.3、反应结束,冷却至室温后,反应产物磁分离,用去离子水反复洗涤至中性,然后超声分散,得到具有良好亲水分散性的fe3o4磁性微球;

s2、fe3o4磁性微球的表面包被修饰:在fe3o4磁性微球表面用sio2包被修饰;

具体步骤包括:

s2.1、取100gfe3o4磁性微球,用无水乙醇清洗三次遍,分散到1l80%的无水乙醇中,移入三颈烧瓶中,室温下以100r/min-500r/min速度搅拌;

s2.2、加入质量浓度为25%氨水,将ph值调节为1l,开启超声,滴加经过重蒸处理过的正硅酸四乙酯的溶液200ml,控制滴加速度为每分钟2ml,滴加完毕后超声反应12h;

s2.3、反应结束后用无水乙醇清洗两遍,再用1mol的稀盐酸清洗2次,然后用去离子水洗涤至中性,得到fe3o4/sio2复合磁性微球。

实施例3:

将上述实施例1中得到的磁性微球应用到人血清游离dna的提取,步骤如下:

1、裂解

取200μl血清样本加入ep管中,加入细胞裂解液200μl、蛋白酶k10μl,混合均匀,把ep管中,置于恒温水箱中70℃温育10-30min;

2、结合

取出ep管,加入振荡混匀的磁性微球10μl,加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,结合5min,将ep管置于磁力架上进行磁分离,吸弃废液;

3、洗涤

加入洗涤液500μl,上下颠倒混匀5-10次,然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;再重复洗涤一次;

室温下开盖干燥10min;

4、洗脱

加入洗脱液50μl,混合均匀,65℃温浴10min,每隔2-3min轻摇ep管混匀,然后磁分离,小心吸取上清液至新的ep管中,进行下游实验;

5、电泳检测

制备浓度1%琼脂糖凝胶,取上述提取的样本基因组进行电泳,50min后在凝胶成像系统上观察电泳结果;结果如图1所示,m:dl100-2000bpmarker;mb1:样本1-3个重复实验;mb2:样本2-3个重复实验;

实施例4:

将上述实施例2中得到的磁性微球应用到人血斑dna的提取,步骤如下:

1、裂解

吸取提前处理过的,含5片血斑片(3mm)的处理液200μl,加入ep管中,加入细胞裂解液200μl、蛋白酶k10μl,混合均匀,把ep管中,置于恒温水箱中70℃温育10-30min;

2、结合

取出ep管,加入振荡混匀的磁性微球10μl,加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,结合5min,将ep管置于磁力架上进行磁分离,吸弃废液;

3、洗涤

加入洗涤液500μl,上下颠倒混匀5-10次,然后磁分离,吸净管盖及管底的残液;再重复洗涤一次;

室温下开盖干燥10min;

4、洗脱

加入洗脱液50μl,混合均匀,65℃温浴10min,每隔2-3min轻摇ep管混匀,然后磁分离,小心吸取上清液至新的ep管中,进行下游实验;

5、电泳检测

制备浓度1%琼脂糖凝胶,取上述提取的样本基因组进行电泳,50min后在凝胶成像系统上观察电泳结果,结果如图2所示,m:dl100-2000bpmarker;mb1:样本1-2个重复实验;mb2:样本2-2个重复实验;样本3-2个重复实验。

本发明通过对上述实施例磁性微球的制备和应用检测,结果证明:本发明制备的磁性微球具有较强磁响应性,该磁性微球具有优良的生物相容性、亲水性以及非常好的化学稳定性和胶体稳定性,主要适用于痕量核酸的分离纯化。

虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。


技术特征:

1.一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:包括以下制作步骤:

s1、fe3o4磁性微球的制备及筛选:铁盐在碱性环境中,采用超声辅助水相共沉淀方法合成fe3o4,以柠檬酸根修饰fe3o4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚;

s2、fe3o4磁性微球的表面包被修饰:在fe3o4磁性微球表面用sio2包被修饰。

2.根据权利要求1所述的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:步骤s1中,fe3o4磁性微球的制备及筛选步骤具体包括:

s1.1、分别配置0.1-1mol的fe3+水溶液与fe2+水溶液,按照fe3+与fe2+物质的量的比为2:1混合置于三口瓶中;

s1.2、上述混合液搅拌均匀后,通入氮气除氧30min,向混合液中加入碱溶液调整ph值为10-12,同时开启超声并剧烈搅拌0.5小时,加入0.1-2mol柠檬酸钠溶液至体系,继续超声搅拌0.5小时,停止超声用水浴锅加热至90℃反应2小时,期间继续机械搅拌并通入氮气;

s1.3、反应结束,冷却至室温后,反应产物磁分离,用去离子水反复洗涤至中性,然后超声分散,得到具有良好亲水分散性的fe3o4磁性微球。

3.根据权利要求2所述的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:步骤s1.2中,通过梯度设置转速和溶液中柠檬酸根的浓度,合成多组fe3o4磁性微球。

4.根据权利要求3所述的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:进行fe3o4磁性微球合成时,搅拌速度分别设置为500r/min、700r/min、900r/min共三个梯度的转速。

5.根据权利要求4所述的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:在三个转速条件下,溶液中柠檬酸根的浓度设置为0.01mol、0.02mol、0.03mol、0.04mol、0.05mol、0.06mol、0.07mol、0.08mol、0.09mol、0.1mol共十种。

6.根据权利要求2所述的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:步骤s1.3中,对于步骤s1.2中合成的多组fe3o4磁性微球根据磁响应强度、粒径大小、悬浮性三个方面进行筛选。

7.根据权利要求1所述的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:步骤s2中fe3o4磁性微球的表面包被修饰的具体步骤包括:

s2.1、取10-100gfe3o4磁性微球,用无水乙醇清洗三次遍,分散到80%的无水乙醇中,移入三颈烧瓶中,室温下以100r/min-500r/min速度搅拌;

s2.2、加入质量浓度为25%氨水,将ph值调节为1l,开启超声,滴加经过重蒸处理过的正硅酸四乙酯的溶液,滴加完毕后超声反应2h~12h;

s2.3、反应结束后用无水乙醇清洗两遍,再用1mol的稀盐酸清洗2次,然后用去离子水洗涤至中性,得到fe3o4/sio2复合磁性微球。

8.根据权利要求7所述的一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,其特征在于:步骤s2.2中,正硅酸四乙酯溶液滴加量为2-200ml,滴加速度为每分钟2ml。

技术总结
本发明公开了一种用于痕量核酸提取纯化的磁性微球制作方法,具体涉及纳米科学技术及生物医药领域,包括以下制作步骤:S1、Fe3O4磁性微球的制备及筛选:采用超声辅助水相共沉淀方法合成Fe3O4,以柠檬酸根修饰Fe3O4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚;S2、Fe3O4磁性微球的表面包被修饰:在Fe3O4磁性微球表面用SiO2包被修饰。本发明通过采用超声辅助水相共沉淀方法制备Fe3O4磁性微球,以柠檬酸根修饰Fe3O4磁性微球表面,使颗粒呈分散状态,减少团聚,然后在Fe3O4磁性微球表面用SiO2包被修饰,制备出具有较强磁响应性的Fe3O4/SiO2亚微米微球,该磁性微球具有优良的生物相容性、亲水性以及非常好的化学稳定性和胶体稳定性。

技术研发人员:肖理慧;王庆专;孙凤娟
受保护的技术使用者:上海领骏生物科技有限公司
技术研发日:2020.03.10
技术公布日:2020.06.26

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