推荐核酸纯化方法

这里写的推荐核酸纯化方法,小编带你解读。 专利名称:核酸纯化方法 核酸纯化方法本发明涉及从含核酸的样品中纯化核酸的方法和试剂盒。现有的技术已公开了各种纯化和分离核酸的方法。包括使用苯酚氯仿、盐析法,使用离

这里写的推荐核酸纯化方法,小编带你解读。

专利名称:核酸纯化方法
核酸纯化方法本发明涉及从含核酸的样品中纯化核酸的方法和试剂盒。现有的技术已公开了各种纯化和分离核酸的方法。包括使用苯酚氯仿、盐析法,使用离子交换剂和二氧化硅颗粒。已知的核酸纯化方法是“电荷转换法”。所述方法包括使核酸结合相在第一 PH值下与含核酸样品接触,在第一 Ph值下,核酸结合相带正电荷。这有利于带负电荷的核酸与所述相结合。根据电荷转换原理,通过调整第二 PH值来释放/洗脱核酸,该第二 PH值高于所述核酸结合相的PKa值,以逆转或中和正电荷。这促使结合的核酸从核酸结合相解离。现有技术已经公开了可溶相(见,例如,EP 0 707 077)和固相(见,例如,WO 99/29703)。各种溶液用以洗脱,例如具有很高pH的溶液或其它生物缓冲液,特别是低盐缓冲液诸如,如Tris缓冲液,以使纯化的核酸立即作进一步处理,例如用于扩增反应或限制性酶消化。即使当已知纯化核酸的方法合适,仍有需要改进现有方法,特别是以一种特别温和的方法来纯化核酸。因此,本发明的目标是改进核酸纯化的现有方法。根据本发明,该目标通过至少包括以下步骤的从含核酸的样品中纯化核酸的方法来实现a.将含有核酸的样品与具有核酸结合基团的核酸结合相接触,所述核酸结合基团具有至少一个PKa在9到12的可质子化基团;b.在比至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的pH值(结合pH)下
使核酸结合核酸结合相;C.在高于结合pH值,但比至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的 PH值(洗脱pH)下洗脱核酸。本发明涉及使用核酸结合相来纯化核酸,所述核酸结合相相应具有核酸结合基团。这种核酸结合基团pKa值为9至12的至少一个可质子化基团。核酸在低于这些可质子化基团中至少一个的PKa值的pH值下结合。所述可质子化基团吸收质子并因此带有正电,导致核酸结合相结合带负电的核酸。洗脱在较高的PH值下实施,从而减少核酸结合相的正电。然而,根据本发明,洗脱PH值低于可质子化基团的pKa值,特别是低至少一个pH 单位,优选低至少两个PH单位。这样可使洗脱在温和条件下实施,因而具有相当大的优势。 因此与现有技术相反,本发明允许在低于可质子化基团PKa值的pH下实施洗脱。根据本发明的一个实施方式,核酸在pH值3到8之间结合。这个信息涉及结合过程中及由此样品中的PH值。根据固相的设计,本发明方法也可在非常温和的条件下实施, 因此核酸甚至可在PH值为4到7. 5,优选5到7. 5,特别优选5到7,很特别优选6. 5到7的 PH值下,因此在实际上中性的范围内结合。由于核酸结合相的可质子化基团的pKa值在9 到12,所述基团即使在相对中性pH值下仍带正电,从而足以使得核酸有效附着。因此结合可以在非常温和的条件下实施,以防核酸破坏。此外,已证明在低盐浓度下实施结合是有优势的。因此,根据一个实施方式,在核酸与核酸结合相结合时所述盐浓度小于1M。所述盐浓度优选小于0. 5M,小于0. 25M或甚至小于0. 1M。为优化核酸与固相的结合,优选低盐浓度。离子浓度过高对核酸和核酸结合相的离子相互作用具有不利影响。我们已发现所述结合缓冲液也可包含一定量的有机物,例如,碳水化合物,醇类,例如乙醇、甲醇或丙酮和乙腈。这些物质不会损害结合。该方法的另一重要步骤是核酸的洗脱。如所示的,核酸在高于结合PH值的pH值下释放。因此,可质子化基团在洗脱期间带有较小的正电,这有利于核酸的释放。此外,洗脱期间PH值比核酸结合相的至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位。因此, 如上所示,洗脱可以在特别温和的条件下实施。根据所采用的核酸结合基团或核酸结合相,洗脱优选在pH值7. 5到11,7. 5到10, 优选在8到9或8. 2到8. 8的pH值之间实施。因为核酸以特别温和的方式释放,这些低pH 值获得了特别有利的结果。下文描述了使核酸在低PH值下,以特别有效的方式释放而采用的其它措施。为了使分离的核酸在洗脱缓冲液中立即接受进一步的加工,所述洗脱缓冲液优选具有低盐浓度。因此,根据一个实施方式,盐浓度小于1M,优选小于0.5M,小于0.25M,小于 0. 1M,特别优选小于50mM,小于25mM或甚至小于10mM。适用的盐可以是碱金属和碱土金属的氯化物或铵盐、其它矿物酸盐、醋酸盐、硼酸盐等以及化合物诸如Tris、Bis-Tris和有机缓冲液,例如MES,CHAPS, HEPES等。此外,现有技术已经描述了适用于洗脱的物质。为了促进纯化,优选在核酸结合后和洗脱前至少实施一个洗涤步骤。优选使用低盐浓度的水性溶液甚至水实施清洗。优选盐浓度小于400mM的洗涤缓冲液,特别优选小于 200mM、100mM、50mM和/或甚至小于25mM。所述洗涤缓冲液可包含有机组分,例如醇类、多元醇、聚乙二醇、丙酮、乙腈或碳水化合物。然而,所述洗涤缓冲液或许不含干扰量的相应有机组分,以免损害后续应用,例如酶处理、扩增反应等(“下游“应用)。根据本发明,所采用的核酸结合相可以是固体或可溶的。可溶的核酸结合相通常在结合pH值下沉淀核酸,而在洗脱pH值下从该沉淀中释放所结合的核酸。现有技术中描述了可溶的核酸结合相或聚合物,例如EP 0 707 077。根据优选的实施方式,核酸结合相是固相。为了制备,所述可质子化基团可结合于例如固体支持材料。下文将详细描述。使用固相促进从样品中移除结合的核酸。因此,根据一个实施方式,核酸结合后移除固相。根据一个实施方式,所述可质子化基团是或具有离子交换剂,优选阴离子交换剂。 经证明优选的用来结合核酸的可质子化基团是氨基,优选伯氨基和仲氨基。所述氨基优选具有9到12的pKa值,优选10到12。所述核酸结合基团优选具有1到10个,特别优选是 2到8且特别是2到6个氨基。优选的核酸结合基团的实例是伯、仲和叔单胺和多胺。这些可经取代或未取代。实例特别是下式所示胺类R1R2R3N,R1R2N(CH2)nNR3R4R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4R5R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2) 0NR5R6R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2) 0NR5 (CH2) pNR6R7R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2)。NR5 (CH2) pNR6 (CH2) ,NR7R8
R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2) 0NR5 (CH2) pNR6 (CH2) qNR7 (CH2) ,NR8R9R1R2N (CH2) nNR3 (CH2) mNR4 (CH2)。NR5 (CH2) pNR6 (CH2) qNR7 (CH2) rNR8 (CH2) 8NR9R10其中η、m、ο、ρ、q、r和s值相互独立为2到8 ;礼、&、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9和Rltl相同或不同,选自由H、烷基(支链或非支链的)
和芳基组成的组。核酸结合基团特别优选N-丙基-1,3-丙二胺和五亚乙基六胺,尤其优选精胺和亚精胺。此外,也可使用环胺、芳香胺或氨基官能化杂环。所述胺类可具有取代基,例如烷基、烯基、炔基或芳香取代基,此外烃链也可封闭成环。烃链也可具有杂原子,例如氧、氮、硫或硅或支链。其他适用的核酸结合基团是具有一个、两个或三个氨基的聚氧化烯胺 (polyoxyalkyleneamine)。例如,可用名称为 “Jeffamine” 的聚氧化烯胺。Jeffamines 包含结合于聚醚骨架末端的伯氨基。所述聚醚骨架可基于环氧丙烷、环氧乙烷或其混合物;也可想到使用其它的骨架区段。如上所述,所述胺类的氨基具有9到12,优选10到12的pKa值。根据本发明,也可以使用相应核酸结合基团的混合物或将其施加于支持物。所述核酸结合基团,例如,胺类可共价地或通过静电、极性或疏水相互作用结合于支持物。优选以这样的方法进行连接,以使每个连接的基团经由可质子化基团提供1(例如 N-丙基-1,3-丙二胺)到10个,优选2到8个,特别优选2到6个氨基。所述核酸结合基团的氨基优选不与降低电子密度的基团,例如,羧基、羰基、具有 C-C双键的基团或β-羟乙基结合,结果是,所述氨基的PKa值为9到12。如果一个氨基官能团和相应的电子密度减少基团仅通过三个、两个或更少的碳原子连接,则认为存在与电子密度降低基团的结合。根据优选的实施方式,所述核酸结合基团结合于固体核酸结合相的支持物以便用于核酸纯化。所述核酸结合基团的合适的支持物的实例是有机聚合物,例如聚苯乙烯及它们的衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及它们的衍生物、或聚氨酯、尼龙、聚乙烯、 聚丙烯、聚丁烯、以及这些材料的共聚物。此外,这些核酸结合基团也可连接于多聚糖, 特别是水凝胶,例如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖Gephadex)、聚丙烯酰胺葡聚糖 (Sephacryl)、壳聚糖。此外,所述核酸结合基团也可连接于无机支持物,例如,硅胶、玻璃或其他金属氧化物及半金属氧化物、二氧化硅、硼氧化物或金属表面,例如金。就操作而言,磁性颗粒特别具有优势。所述核酸结合基团可直接地或通过“间隔臂”结合于所述支持物。它们也可以是较大分子的一部分。间隔臂的实例为烃链、聚乙二醇或聚丙二醇及官能化硅烷。 所述间隔臂可是支链或非支链的。可用于连接核酸结合基团的化学官能团为酰胺或酸酐、环氧化物、三氟代乙烷磺酰基(tresyl)、甲酰基、磺酰氯、马来酰亚胺或碳二亚胺化学活化羧酸酯基。在本发明范围内,也可以非共价键地通过例如离子相互作用或通过吸附过程来连接核酸结合基团,例如胺类。例如,所述核酸结合基团也可通过硫醇连接到金表面。优选将核酸结合基团连接到羧化表面。
所述支持材料的其它实施方式包括非磁性和磁性颗粒、柱形材料、膜和表面涂层。还有官能化的支持物,诸如管、膜、无纺布、纸张、反应容器诸如PCR容器、“埃氏 (Eppendorf)管”、多盘片、芯片和微阵列。如上所述,本发明另一实施方式涉及可溶性聚合物,根据本发明,所述聚合物包含可质子化基团,根据本发明的原理,所述聚合物能可逆地结合核酸。还可以根据本发明改性的合适的可溶相的实例在例如EP O 707 077中进行了描述。优选的溶剂是水,但是也可以使用聚合物,所述聚合物已经根据本发明被官能化,并且所述聚合物在,例如乙醇的有机溶剂中可溶。令人惊讶的是,我们发现结合缓冲液和洗脱缓冲液中可应用的pH值和盐浓度与每个核酸结合基团中存在的可质子化基团,特别是氨基的数目相关。因此,在大约50mM的盐浓度下,核酸甚至可在PH 6下与精胺包被的表面结合,而N-丙基-1,3-丙二胺包被表面的应用优选更低的PH 5. 5,甚至优选pH 5。在50mM的盐浓度下,从N-丙基-1,3-丙二胺表面洗脱甚至在PH 7. 5下也是成功的,而精胺包被的表面需要约为8.5的pH值。然而,为了通过改变所述支持物以洗脱还需要降低PH值(见下文)。有效的洗脱和因此结合的核酸从核酸结合相的解离对于核酸的纯化效率特别重要。在此,令人吃惊地发现不仅核酸结合基团的可质子化基团的PKa值至关重要。核酸结合相的结构和其它官能基团的存在也有助于促进和改善在中性或弱碱性PH值范围下洗脱。根据一个实施方式,所述核酸结合相额外带有一些官能基团,所述官能基团可通过例如施加排斥效应来促进在洗脱PH下核酸的洗脱。因此,这些官能基团优选在洗脱期间带负电。这些基团的PKa值可以是,例如,在0到7的范围,优选1到5。适用的是,例如,离子交换剂,特别是阳离子交换剂,优选酸性基团诸如,例如羧基。其它适用的基团是甜菜碱、 磺酸盐或酯、膦酸盐或酯和磷酸盐或酯。例如,所述固体支持物可用羧基官能化,以便连接核酸结合基团。用于连接的核酸结合基团的浓度的选择应使一些羧基是游离的,因此没用核酸结合基团官能化。这些基团在低PH值下不损害核酸的结合。然而,在较高的pH值下, 它们易带负电,因此促进核酸从核酸结合基团解离。可以通过选择核酸结合基团的可质子化基团和可负电离基团,例如羧基之间的长度或距离来促进这种相互作用。这有利地促进低PH值下的洗脱,从而增加产量。在洗脱pH值下对核酸施加排斥效应的所述官能基团的选择、强度和长度根据所选核酸结合基团,因此特别根据每一核酸结合基团的可质子化基团数量以及它们与洗脱促进官能基团的距离而有所不同。我们还证明,如果核酸结合/可质子化基团彼此以一定距离排列在支持材料上或是被稀释,也可以增加洗脱效率。根据一个实施方式,可以通过仅用少量核酸结合基团包被支持物来实现核酸结合基团的这种排列。因此优选用亚化学计量的核酸结合基团实施官能化。结果是,核酸结合基团在支持物上基本上被稀释并且,因此仅有更少的核酸结合基团可用。这样可促进洗脱因为核酸结合的不太紧密并且因此更易于从核酸结合相再次解离。例如,可以用核酸结合基团官能化支持材料上仅< 50%、< 25%,^ 15%,^ 10%或仅< 5% 的官能基团。如果所述支持材料没有任何适用的官能基团用于连接核酸结合基团,那么可以先官能化支持材料来为其提供适用的官能基团(见上文)。为了这个目的,也可以通过给支持材料提供相应的较少的官能基团以便连接所述核酸结合基团也可实现用亚化学计量核酸结合基团包被支持材料的合适属性。
根据另一个实施方式,支持材料用核酸结合基团与“稀释基团”的混合物包被。本文使用术语“稀释基团”是为了说明其相对于核酸结合基团的功能。其功能包括调整支持物上的核酸结合基团量,从而也影响了核酸的结合强度。所述稀释基团的比例越高,应用于支持物的核酸结合基团就越少,且核酸结合的强度越低。所述稀释基团可带负电、正电或是中性或具有可电离基团。因此,稀释基团也可同时具有可促进洗脱的官能基团(见上文)。 相对于稀释基团,核酸结合基团的比例可以是,例如,彡50K 25K 15%、彡10%或仅 <5%。适用的稀释基团的实例是胺、二甲胺、二乙胺和氨。根据一个优选的实施方式,一种常见的单胺和多胺的混合物(现有技术已知的)根据本发明应用于支持物。在这个组合中,多胺用于连接核酸,而单胺主要作为稀释基团起作用。一个适用的稀释基团的实例可以是乙醇胺。就洗脱条件而言,核酸结合相的pH值可通过选择/组合所述参数,特别是促进洗脱的官能基团、稀释基团、和稀释度以及含核酸结合基团的混合物。因此,可控制或调节核酸结合相的洗脱属性,特别是洗脱PH值。本发明系统可纯化的核酸可以存在于体液,例如血液、尿液、粪便、唾液、痰、或其它体液,可存在于生物来源,例如组织、细胞特别是动物细胞、人体细胞、植物细胞、细菌细胞等,器官,例如肝脏、肾或肺等。此外,核酸也可以从支持材料获取,例如,棉签、巴氏涂片, 可从稳定的媒介获取,例如I^reServCyt或Sur印ath,或从其它液体获取,例如果汁、水性样品或通常的食物。此外,核酸也可从植物材料、细菌裂解物、石蜡包埋组织、水性溶液或凝胶中获取。此外,本发明涉及上述核酸相结合相对于纯化核酸的应用。本发明所采用的核酸结合相特别具有核酸结合基团,该基团具有PKa值为9到12的至少一个可质子化基团。优选实施方式已在上文详细描述(见以上内容),其特征尤其在于以下一种或是多种特征a)所述核酸结合相为固体或是可溶的;和/或b)所述核酸结合相具有结合于固体支持物的核酸结合基团;和/或C)所述核酸结合相还具有可在洗脱pH值下促进核酸的释放/洗脱的官能基团,所述官能基团优选阳离子交换剂,特别是羧基;和/或d)特征b)或C)的核酸结合相具有选自下组的支持物有机多聚物诸如聚苯乙烯及它们的衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及它们的衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物,多糖和水凝胶,例如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺葡聚糖、壳聚糖,无机支持物,特别是硅胶、二氧化硅颗粒、玻璃或其他金属和半金属氧化物、氧化硼、具有金属表面的支持物,例如金和磁性颗粒;和/或e)所述核酸结合相的核酸结合基团是胺类,特别是伯胺和仲胺;和/或f)特征e)的核酸结合基团特别是精胺和/或亚精胺。本发明进一步提供了用于纯化核酸的试剂盒,所述试剂盒的特征在于其具有a)本发明的核酸结合相,所述核酸结合相具有核酸结合基团,而所述核酸结合基团具有PKa值为9到12的至少一个可质子化基团;和b)其pH值比核酸结合相的至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的结合缓冲液,和/或可调节样品中的PH值至此类pH值的结合缓冲液;c)其pH值比核酸结合相的至少一个可质子化基团的PKa值低至少一个pH单位,但是高于结合缓冲液的PH值的洗脱缓冲液,和/或可调节样品中的pH值至此类pH值的洗脱缓冲液。核酸结合相和洗脱条件的细节上文已描述,也适用于本发明试剂盒,且表征了其中所用的组分/缓冲液。参考以上公开内容。此外,该试剂盒可包含其他惯用组分,例如裂解液,洗涤和/或中和试剂和/或缓冲液。所述结合缓冲液优选具有至少一项以下特征i.pH值为3到8 ;和/或ii. pH 值为 4 到 7. 5 ;和 / 或iii.pH 值为 4. 5 到 7 ;和 / 或iv. pH 值为 5. 5 到 7 ;和 / 或v. pH 值为 6. 5 到 7 ;和 / 或vi.盐浓度小于1M、小于0. 5M、小于0. 25M或小于0. IM0所述相应特征的优势已经在上文与方法相结合进行了说明,参考以上公开内容。根据本发明,洗脱缓冲液可具有至少一项以下特征i.pH 值为 7. 5 到 10 ;和 / 或ii.pH值为8到9 ;和/或土土土.?!1值为8.2到8.8;禾口/或iv.盐浓度小于1M、小于0. 5M、小于0. 25M、小于0. 1M、小于25mM、小于15mM或 IOmM ;禾口 / 或v.选自下组水、生物缓冲液、有机缓冲液,特别是1^8、1^8^8、1^5、(拟 5和 HEPES0所述相应有关的相应细节和优势已经在上文与根据本发明的方法相结合进行了说明。参考以上公开内容。相应试剂盒特别适用于本发明方法的范围内。本发明方法、试剂盒和核酸结合固相尤其可用在分子生物学领域、分子诊断领域、法医领域、食品分析领域和应用检测领域。优选可使核酸洗脱后能够立即接受进一步处理,因此可用于,例如PCR、RT_PCR、限制性酶消化或转录。只要洗脱缓冲液是按照上述设计的并优选具有低盐浓度,不需要进一步的纯化。适用于纯化的核酸是DNA和RNA,特别是基因组DNA、质粒DNA、还有PCR片段、 cDNA、miRNA、siRNA、以及寡核苷酸和修饰的核酸,例如PMA或LMA。也可以纯化病毒或细菌 RNA和DNA或人、动物或植物来源的核酸。DNA/RNA杂链也适合本发明纯化方法。下面将基于一些实施例对本发明进行说明。这些例子并不是限制性的,而是本发明的优选实施方式。此外,本文引述的所有参考文献通过引用纳入本文。
实施例本实验所用的核酸模型系统是未切开的pUC21质粒DNA、RNA和基因组DNA。此夕卜, 通过使用被限制性酶切成片段的质粒DNA来表示不同大小的核酸片段的纯化。步骤(实验部分)在以下A)到I)的制备方法之后A)磁性聚合物与胺类反应
材料磁性聚合物=Sera-Mag倍速磁性改性羧酸盐微粒(kra-Mag Double Speed Magnetic Carboxylate-Modified Microparticles, dsMGCM)目录号 65152105050250,5% 强度水性悬液,或磁性改性羧酸盐(MG-CM),目录编号对15-2105,5%强度水性悬液,SD公司(Seradyn Inc).印第安纳波利斯,美国。胺类精胺(弗氏公司(Fluka),85590),亚精胺(弗氏公司,85561),丙基_1,3丙二胺(阿尔德里奇公司(Aldrich),目录号308153),五亚乙基六胺(阿尔德里奇公司,目录号四2753)聚(烯丙胺盐酸盐),分子量15 000(阿尔德里奇公司,目录号观3215)将500mg的磁性颗粒重悬于IOml 50mM、pH 6. 1的MES缓冲液中,然后与11. 5ml 50mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合。使用微型振荡器混合后,加入10ml、52 μ mol/1 的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶液,接着再次涡旋混合。接着将该溶液置于翻滚式振荡器上反应30分钟,然后移除上清。重悬于50ml 50mM、pH6. 1的MES缓冲液之后,将悬液分成每IOml的等份。磁性分离该悬液并弃去上清。在悬浮于Iml 50mM、 pH 6. 1的MES缓冲液后,每一例中加入2ml胺使得在50mM MES中浓度为100mg/ml、且pH 为8. 5,接着充分涡旋混合,超声10分钟,然后将该悬液置于翻滚式振荡器上反应1个小时。 接着洗涤2次每一例使用IOml 50mM、pH 6. 1的MES缓冲液,磁性分离并弃去上清。然后将每例颗粒重悬于2ml pH值4. 5到7. 0的MES缓冲液中。B)使用N-丙基-1,3-丙二胺官能化的磁性聚合物(AX 027)纯化pUC21质粒使用pH5. 0或是5. 5的50mM MES缓冲液中的^ig磁性颗粒,每一例与50 μ 1 50mM、 pH 5. 0或5. 5的MES缓冲液混合。接着加入10 μ 1的“ΕΒ”缓冲液(恰根公司(QIAGEN), 目录号19068)中的10ygpUC21质粒,并简单震荡混合。然后该反应混合物在翻滚式振荡器或是埃氏振荡器上孵育5分钟。磁性分离该样品混合物并移除上清,并用光度法测定其中DNA含量。然后每一例中的残余用100 μ 1的Millipore水洗涤2次,磁性分离,并弃去上清。接着洗脱2次向每一例中加入50 μ 1 50mM, pH 8. 5,NaCl浓度为50mM、100mM、200mM 和400mM的Tris缓冲液,用磁性分离方法移除,并用光度法检测洗脱液中DNA的含量。

图1描述了 50mM浓度NaCl洗脱的结果,同时也对比了 AX 0 和AX 027的结果。C)使用亚精胺官能化的磁性聚合物(AX 026)纯化pUC21质粒使用pH 6. 2的50mM MES缓冲液中的2mg磁性颗粒,并与50 μ 1 50mM、pH 6. 2的 MES缓冲液混合。接着加入10μ Γ Β”缓冲液(恰根公司,目录号19068)中的10 μ g pUC21 质粒,并简单震荡混合。然后该反应混合物在翻滚式振荡器或是埃氏振荡器上孵育5分钟。 磁性分离该样品混合物并移除上清,用光度法测定其中DNA含量。然后每一例中的残余用 100μ 1的Millipore水洗涤2次,磁性分离,并弃去上清。接着洗脱2次向每一例中加入 50 μ 1 50mM, pH 7. 5,8. 0 和 8. 5 的 Tris 缓冲液,每一例中 NaCl 浓度为 50mM、100mM、200mM 和400mM,用磁性分离方法移除,并用光度法检测洗脱液中DNA的含量。图2描述了该结果。D)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 025)纯化pUC21质粒使用pH 6. 1的50mM MES缓冲液中的2mg磁性颗粒,并与50 μ 1 50mM、pH 7. 0的 MES缓冲液混合。接着加入10 μ 1的‘ Β”缓冲液(恰根公司,目录号19068)中的IOyg PUC21质粒,并简单震荡混合。然后该反应混合物在翻滚式振荡器或是埃氏振荡器上孵育5分钟。磁性分离该样品混合物并移除上清,并用光度法测定其中DNA含量。然后每一例中的残余用100 μ 1的Millipore水洗涤2次,磁性分离,并弃去上清。接着洗脱2次向每一例中加入50 μ 1 50mM,pH7. 5、8· 0和8. 5的Tris缓冲液,每一例中NaCl浓度为50mM、100mM、 200mM和400mM,用磁性分离方法移除,并用光度法检测洗脱液中DNA的含量。图3描述了该结果。E)使用五亚乙基六胺官能化的磁性聚合物(AX 028)纯化pUC21质粒使用pH 6. 1的50mM MES缓冲液中的2mg磁性颗粒,并与50 μ 1 50mM、pH 7. 0的 MES缓冲液混合。接着加入10μ Γ Β”缓冲液(恰根公司,目录号19068)中的10 μ g pUC21 质粒,并简单震荡混合。然后该反应混合物在翻滚式振荡器或是埃氏振荡器上孵育5分钟。 磁性分离该样品混合物并移除上清,并用光度法测定其中DNA含量。然后每一例中的残余用100μ 1的Millipore水洗涤2次,磁性分离,并弃去上清。接着洗脱2次向每一例中加入 50 μ 1 50mM, pH 7. 5、8· 0 和 8. 5 的 Tris 缓冲液,每一例中 NaCl 浓度为 50mM、100mM、 200mM和400mM,用磁性分离方法移除,并用光度法检测洗脱液中DNA的含量。图4描述了该结果。F)使用聚烯丙胺官能化的磁性聚合物(AX 029)纯化pUC21质粒-对比实施例使用pH 6. 1的50mM MES缓冲液中的2mg磁性颗粒,并与50 μ 1 50mM、pH 7. 0的 MES缓冲液混合。接着加入10μ Γ Β”缓冲液(恰根公司,目录号19068)中的10 μ g pUC21 质粒,并简单震荡混合。然后该反应混合物在翻滚式振荡器或是埃氏振荡器上孵育5分钟。 磁性分离该样品混合物并移除上清,并用光度法测定其中DNA含量。然后每一例中的残余用100μ 1的Millipore水洗涤2次,磁性分离,并弃去上清。接着洗脱2次向每一例中加入 50 μ 1 50mM, pH 7. 5、8· 0 和 8. 5 的 Tris 缓冲液,每一例中 NaCl 浓度为 50mM、100mM、 200mM和400mM,用磁性分离方法移除,并用光度法检测洗脱液中DNA的含量。图5描述了该结果。G)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 030)纯化基因组DNA对于每次纯化,将ang的颗粒悬于pH 6. 2的25mMMES、25mM Tris中。接着加入缓冲液“EB”配制的IOyg小牛胸腺基因组DNA(目录号19068,弗氏公司,德国),并简单震荡混合。接着磁性分离该样品并作光度法检测。残余用100μ 1的Millipore水洗涤,磁性分离以移去上清,接着洗脱2次,每例使用50 μ 1分别含50mM和IOOmM NaCl的50mM、pH 8. 5 的Tris缓冲液。然后用光度法检测每个洗脱液中DNA的含量。图6和图7描述了该结果。H)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 030)纯化RNA.对于每次纯化,将ang的颗粒悬于50mM、pH 5. 5的Tris中。接着将10 μ g/制备 (pr印)· RNA(核醣体的 16S-& 23S、Fermentas41-lg/l_ll)加入到 50mMpH 5. 5 的 Tris 缓冲液中。接着通过简单震荡的方法混合,磁性分离并接着用光度法检测上清的RNA。接着每一例用100μ 1无RNA酶的水洗涤两次,通过磁性分离去除上清。接着洗脱两次,每例使用 50 μ 1分别含50mM和IOOmM NaCl的50mM、pH 8. 5的iTris (无RNA酶)。然后用光度法分别检测洗脱液。图8和图9描述了该结果。I)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 030)纯化核酸片段.
准备精胺官能化的磁性聚合物颗粒以50mg/ml的悬浮密度悬于含25mM MES、25mM Tris、pH 6. 2的结合缓冲液。然后用该缓冲液再洗涤所述珠粒2次,用磁性分离方法去除上清。需要的是PTZ19R型质粒DNA,将25 μ g的该DNA用于100 μ 1的缓冲溶液。首先,计算出所有用于反应混合物的量,接着引入缺失的水量以补齐100μ 1,加入DNA,然后加入酶溶液的匹配酶缓冲液(每10 μ 1总溶液加1 μ 1),最后每yg DNA加入3U限制性内切酶 (HinfI,新英格兰生物实验室(New England Biolabs),目录号R0155S)(通常75U对应于 7.54 1酶溶液)。该混合物置于37°C水浴或加热器孵育90分钟。接着用Quick-Run简单离心至6000U/min,然后样品冻于_20°C。这种限制酶消化的DNA是试验PB缓冲液的一种简单和快速的PCR替代品。过程对于每一样品,8μ1的PCR溶液(相当于2yg DNA)同92 μ 1 ρΗ 6· 2的25mM MES、25mM Tris混合,然后混入25 μ 1磁性硅胶悬液,然后涡旋震荡10秒钟,混入500 μ 1 ρΗ 6. 2的25mM MES、25mM Tris,并混合。混合物在振荡器中孵育2分钟。接着磁性分离,弃去上清,每例用750 μ 1 Millipore水洗涤2次。然后,先用50 μ 1,再用30 μ 1 ρΗ 8. 5、50mM Tris/HCl,50mM NaCl洗脱。合并洗脱液,用分光法,也可通过凝胶法检测DNA含量。图10、图11、图12描述了该结果。J)使用精胺官能化的磁性聚合物(AX 040)从血中纯化基因组DNA.Iml 裂解缓冲液(IOmM Tris, Triton X_100,pH 9.0)和 10 μ 1 蛋白酶 K 混合。将 Img珠粒和3. 4 μ 1水悬于200 μ 1结合缓冲液(1. 5Μ乙酸钾、ρΗ 4. 0),悬液密度26. 6mg/ml。 将100 μ 1解冻的全血(柠檬酸盐稳定的)和裂解缓冲液/蛋白酶混合物混于埃氏杯,充分混合。接着室温孵育10分钟。将珠粒小心重悬于结合缓冲液中。其中的240μ1加入裂解的血中,接着用移液管小心上下吹吸混勻。接着室温孵育1分钟。磁性分离珠粒。小心移去上清。为洗涤,加入Iml洗涤缓冲液(水),然后小心地上下吹吸混勻。再一次磁性分离后,弃去上清。加入Iml裂解缓冲液和50 μ 1结合缓冲液,小心混合并室温孵育1分钟。然后通过以下再次磁性分离用Iml洗涤缓冲液洗涤并磁性分离。通过加入150 μ 1洗脱缓冲液(IOmM TRIS*HC1、ρΗ 8. 5)至珠粒洗脱纯化的DNA。 通过上下吹吸数次重悬珠粒。磁性分离珠粒,移去上清,并用光度法定量DNA。图13描述了该结果。将5 μ 1以上所获的洗脱液用于RT-PCR。为此,使用了 TaqMan β -肌动蛋白对照试剂(应用生物系统公司(Applied Biosystems),编号401846)和QuantiTect探针PCR 主混合物(恰根公司,编号1019337),应用了 12.5μ 1主混合物、2. 5 μ 1 β -肌动蛋白探针 (FAM)、2. 5μ 1 β-肌动蛋白正向引物和2. 5μ 1 β-肌动蛋白反向引物。图14描述了该结果。
权利要求
1.从含核酸样品中纯化核酸的方法,所述方法至少具有以下步骤a.将含有核酸的样品与具有核酸结合基团的核酸结合相接触,所述核酸结合基团具有 PKa值在9到12的至少一个可质子化基团;b.在比至少一个所述可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的pH值(结合pH)下使所述核酸结合所述核酸结合相;c.在高于所述结合pH值,但是比至少一个所述可质子化基团的pKa值低至少一个pH 单位的PH值下洗脱所述核酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸结合基团结合于支持物。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述支持物和/或核酸结合基团具有官能基团,所述官能基团在洗脱PH值下促进核酸释放。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述官能基团是阳离子交换剂,特别是酸性基团,优选例如羧基。
5.如权利要求2至4中的任一项所述的方法,其特征在于,所述支持用核酸结合基团和稀释基团的混合物包被。
6.如权利要求1至5中一个或多个所述的方法,其特征在于,在具有至少一个以下特征的条件下实施结合a.在3到8的pH下实施结合;和/或b.在4到7.5的pH下实施结合;和/或c.在4.5到7的pH下实施结合;和/或d.在5.5到7的pH下实施结合;和/或e.在6.5到7的pH下实施结合;和/或f.在小于1M、小于0.5M、小于0. 25M或小于0. IM的盐浓度下实施结合。
7.如权利要求1到6中一个或多个所述的方法,其特征在于,在具有至少一个以下特征的条件下实施洗脱a.在7.5到10的pH下实施洗脱;和/或b.在8到9的pH下实施洗脱;和/或c.在8.2到8. 8的pH下实施洗脱;和/或d.在小于1M、小于0.5M、小于0. 25M、小于0. 1M、小于25mM、小于15mM或小于IOmM的盐浓度下实施洗脱;和/或e.使用选自下组的溶液实施洗脱水、生物缓冲液和有机缓冲液。
8.如权利要求1到7中一个或多个所述的方法,其特征在于,在结合后、洗脱前实施洗涤步骤。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所用的洗涤溶液具有以下一个或多个特征a.使用水或低盐浓度水性溶液实施洗涤步骤;和/或b.使用低盐浓度水性溶液,所述盐浓度低于400mM、低于200mM、低于100mM、低于50mM 和/低于25mM0
10.如权利要求1到9中一个或多个所述的方法,其特征在于,所述核酸结合相是固相的或可溶于于水性溶液。
11.如权利要求1到10中一个或多个所述的方法,其特征在于,所述可质子化基团具有以下一个或多个特征a.所述可质子化基团是或具有离子交换剂;和/或b.所述可质子化基团是氨基;和/或c.所述可质子化基团是PKa为10到12的氨基;和/或d.所述核酸结合基团中每个基团具有1到10个、优选2到8个、特别优选2到6个氨基;和/或e.所述核酸结合基团选自精胺和/或亚精胺;和/或f.所述可质子化基团为氨基且不与减少电子密度的基团结合。
12.具有核酸结合基团的核酸结合相在纯化核酸中的应用,所述核酸结合基团具有至少一个可质子化基团,所述可质子化基团的pKa为9到12,且洗脱pH被调整到高于结合pH, 但是比至少一个可质子化基团地至少一个PH单位。
13.如权利要求12所述的应用,其特征在于,所述核酸结合相具有至少一个以下特征a)所述核酸结合相为固相或是可溶的;和/或b)所述核酸结合相具有结合于固体支持物的核酸结合基团;和/或c)所述核酸结合相还具有在洗脱pH值下促进核酸的释放/洗脱的官能基团,优选阳离子交换剂,特别是羧基;和/或d)特征b)或c)的核酸结合相具有选自下组的支持物有机多聚物,例如聚苯乙烯及它们的衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及它们的衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物,多糖和水凝胶,例如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖、 聚丙烯酰胺葡聚糖、壳聚糖,无机支持物,特别是硅胶、二氧化硅颗粒、玻璃或其他金属和半金属氧化物、氧化硼,具有金属表面的支持物,例如金和磁性颗粒;和/或e)所述核酸结合相的核酸结合基团是胺类,特别是伯胺和仲胺;和/或f)特征e)的核酸结合基团是精胺和/或亚精胺。
14.用于纯化核酸的试剂盒,特征在于其具有a.如权利要求12或13所限定的核酸结合相;b.pH值比核酸结合相的至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的结合缓冲液,和/或可调节样品中的PH值至此类pH值的结合缓冲液;和c.pH值比核酸结合相的至少一个可质子化基团的PKa值低至少一个pH单位的洗脱缓冲液,和/或可调节样品中的PH值至此类pH值的洗脱缓冲液。
15.如权利要求14所述的试剂盒,其特征为a.所述结合缓冲液至少具有以下特征之一i.PH为3到8 ;和/或ii.pH为4到7.5 ;禾口 /或iii pH为4. 5到7 ;禾口 /或iv.pH为5. 5到7 ;禾口 /或v.pH为6. 5到7 ;和/或vi盐浓度小于1M、小于0. 5M、小于0. 25M或小于0. IM ;和/或b.所述洗脱缓冲液至少具有以下特征之一i. pH为7. 5到10 ;和/或ii.pH为8到9 ;禾口 /或 iii pH 为 8. 2 到 8. 8 ;和 / 或iv盐浓度低于1M、低于0. 5M、低于0. 25M、低于0. 1M、低于25mM、低于15mM或低于 IOmM ;禾口 / 或v.其选自水、生物和有机缓冲液。
全文摘要
本发明涉及从含核酸的样品中纯化核酸的方法,所述方法至少包括以下步骤a.将含有核酸的样品与包含可质子化基团的核酸结合相接触,其中所述可质子化基团具有9到12的pKa值;b.在比至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的pH值(结合pH)下使核酸结合核酸结合相;c.在高于结合pH值,但比至少一个可质子化基团的pKa值低至少一个pH单位的pH值(洗脱pH)下洗脱核酸。还公开了可用于纯化核酸的相应试剂盒和核酸结合相。
文档编号C12N15/10GK102264901SQ200980152956
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者J·佩策耳, R·法比斯, S·简里奇 申请人:恰根有限公司

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