最新一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法

如下介绍的最新一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法,小编为你揭晓内容

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一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法

[0001] 本发明属于生物技术中荧光蛋白质和重组抗体领域,具体的说是涉及一种大肠杆 菌中融合荧光蛋白质的制备方法。

[0002] 藻胆蛋白是藻类重要的色素蛋白,具有光能捕获和传递的作用。每分子的藻胆蛋 白含有两条结构相似的多肽链α和β,α亚基和β亚基分别含有约160~180个氨基酸 残基,二者的比例通常为1:1。亚基中的半胱氨酸残基通过硫醚键与藻胆色素共价结合,藻 胆色素的种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定了藻胆蛋白的光谱学性质。根据吸收光谱 的不同,可将藻胆蛋白分为4大类:即藻红蛋白PE, λ_= 540nm~570nm,藻红蓝蛋白PEC, Xmax= 567nm,藻蓝蛋白 PC,λ max= 615nm ~640nm 和别藻蓝蛋白 APC,λ max= 650nm ~ 655nm〇
[0003] 藻胆蛋白能发出强烈的荧光,其荧光特性最重要的用途是在免疫诊断用荧光标 记、生物医学研究等方面,可将其与生物素、亲和素或各种抗体结合制成荧光探针,用于免 疫荧光分析和检测等工作中。
[0004] 在免疫荧光分析中,藻胆蛋白作为荧光标记物需要与抗体结合,即通过双功能试 剂将藻胆蛋白分子与抗体分子共价交联,或通过生物素?亲和素系统(BAS)将藻胆蛋白分 子间接耦联到抗体分子上。无论通过何种方式标记,都需要分别制备藻胆蛋白和抗体。藻 胆蛋白与抗体通过化学交联剂直接交联,可能会降低抗体活性和藻胆蛋白的荧光强度。而 通过生物素?亲和素系统,则需要将藻胆蛋白和链霉亲和素通过化学交联的方式偶联起来, 抗体则需要经过生物素化处理。因此,藻胆蛋白和抗体无论是通过直接交联还是通过BAS 系统间接偶联,过程均较复杂,制备的成本很高。简化制备步骤,降低生产成本,将有助于拓 展藻胆蛋白荧光探针的应用。
[0005] 单链抗体是一种小分子抗体,它由一段弹性连接链把抗体重链可变区与轻链可变 区相连而成,是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。它具有分子量小, 只有完整抗体分子的1/6,能以单价的形式结合特异性抗原,免疫原性低,组织穿透力强,可 以利用基因工程方法进行异源表达,从而降低生产成本。



[0006] 本发明目的在于提供一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法。
[0007] 为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
[0008] -种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法:将AFP单链抗体基因和别藻蓝蛋白 α亚基基因通过linker序列拼接成嵌合基因,并将该嵌合基因、藻胆蛋白裂合酶基因和藻 胆色素生物合成酶基因在大肠杆菌中共表达,获得共价结合藻红胆素的融合荧光蛋白质或 共价结合藻蓝胆素的融合荧光蛋白;
[0009] 所述藻胆色素为藻红胆素或藻蓝胆素。
[0010] 具体是:
[0011] 1)利用融合PCR,将AFP单链抗体基因,linker序列和别藻蓝蛋白亚基基因连接 形成嵌合基因,将该嵌合基因插入到大肠杆菌表达载体PCDFDuet-I的一个表达框中;将裂 合酶基因 cpcS插入到该表达载体的另一个表达框中;
[0012] 2)将藻红胆素生物合成酶基因 Hol和pebS,分别插入到另一个表达载体 pRSFDuet-1的两个表达框中;
[0013] 3)将两个构建好的表达载体同时转化大肠杆菌,得到重组大肠杆菌;
[0014] 4)将重组大肠杆菌进行发酵培养,IPTG诱导融合蛋白表达,通过复性和金属螯合 亲和层析纯化,得到共价结合藻红胆素的融合荧光蛋白质。
[0015] 所述别藻蓝蛋白α亚基基因是别藻蓝蛋白Synechococcus CC9311 α亚基或其 同源基因,藻红胆素生物合成酶基因 Hol是Synechocystis sp.PCC6803 Hol基因,pebS是 指 Prochlorococcus phage P-SSM2 的 pebS 基因 ,cpcS 是指 Synechoccus elongatus BP-1 cpcS 基因(T11 1699) ,linker 序列是:
[0016] GGATCCGCCGAAGCGGCCGCAAAAGAAGCTGCGGCCAAGGAAGCAGCTGCGAAAGAAGCCGCAGCTAAG GCGGAATTCo
[0017] 具体是:
[0018] 1)利用融合PCR,将AFP单链抗体基因,linker序列和别藻蓝蛋白α亚基基因连 接形成嵌合基因,将该嵌合基因插入到大肠杆菌表达载体pCDFDuet-Ι的一个表达框中;将 裂合酶基因 cpcS插入到该表达载体的另一个表达框中;
[0019] 2)将藻蓝胆素生物合成酶基因 Hol和PcyA分别插入到另一个表达载体 pRSFDuet-1的两个表达框中;
[0020] 3)将两个构建好的表达载体同时转化大肠杆菌,筛选出同时表达上述多个基因的 菌株并能够生产融合荧光蛋白质的菌株,即得表达菌株;
[0021] 4)将表达菌株进行发酵培养,IPTG诱导融合蛋白表达,利用金属螯合亲和层析纯 化,从而得到共价结合藻蓝胆素的融合荧光蛋白质。
[0022] 所述别藻蓝蛋白α亚基基因是别藻蓝蛋白Synechococcus CC9311 α亚基或其同 源基因,藻蓝胆素生物合成酶基因 Hol是Synechocystis sp. PCC6803 Hol基因,pcyA是指 Synechocystis sp. PCC 6803 的 pcyA 基因,裂合酶基因 cpcS 是指 Synechoccus elongatus BP-1 cpcS 基因(T11 1699) ,linker 序列是:
[0023] GGATCCGCCGAAGCGGCCGCAAAAGAAGCTGCGGCCAAGGAAGCAGCTGCGAAAGAAGCCGCAGCTAAG GCGGAATTCo
[0024] 与现有技术相比,本发明具有以下优点:
[0025] 1.本发明中融合荧光蛋白质是通过基因工程方式获得,不需要单独制备抗体和藻 胆蛋白,降低了制备成本;
[0026] 2.本发明中抗体和藻胆蛋白通过融合表达,两者之间直接结合,不需要通过化学 交联剂处理,简化制备流程;
[0027] 3.本发明利用大肠杆菌发酵生产AFP单链抗体和别藻蓝蛋白α亚基融合蛋白 (scFv-apcA),大肠杆菌易于培养、生长快,缩短生产周期;
[0028] 4.大肠杆菌易于破碎,由于重组蛋白携带HIS标签,利用亲和层析可获得高纯度 的重组蛋白,简化纯化过程;
[0029] 5.融合荧光蛋白质共价结合藻红胆素或藻蓝胆素,为免疫荧光检测提供更多选 择。

[0030] 图1是本发明实施例的经过纯化后的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PEB的吸收光 谱。
[0031] 图2是本发明实施例的经过纯化后融合荧光蛋白质scFv-apcA-PEB的荧光发射光 谱。
[0032] 图3是本发明实施例的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PEB蛋白竞争性抑制试验图。

[0033] 图4是本发明实施例的经过纯化后的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PCB的吸收光 谱。
[0034] 图5是本发明实施例的经过纯化后融合荧光蛋白质scFv-apcA-PCB的荧光发射光 谱。
[0035] 图6是本发明实施例的融合荧光蛋白质scFv-apcA-PCB蛋白竞争性抑制试验图。

[0036]
[0037] 下面通过实施例对本发明的进行阐述,所述的实施方式仅仅用来解 释和说明本发明,其并不限制本发明的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和 现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。
[0038] 实施例1
[0039] L基因的克隆
[0040] 从美国国立生物信息中心(National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取 Synechococcus CC9311 apcA,Synechocytissp. PCC 6803 Hoi, Prochlorococcus phage P-SSM2 pebS, Synechococcus elongatus BP-I cpcS 和 AFP单链抗体scFv基因序列(Accession No.AGQ46838)。由此分别设计扩增apcA,Hol, cpcS和scFv基因的特异引物(表1)。apcA基因以CC9311基因组DNA为模板,Hol以 Synechocytissp. PCC 6803 基因组 DNA 为模板,cpcS 以 Synechococcus elongatus BP-1 基 因组DNA为模板,按常规PCR条件扩增获得。pebS、scFv基因和linker序列由南京金斯瑞 生物科技有限公司人工合成。为了便于融合PCR反应,linker序列人工合成过程中,在其 5'端和3'端分别加上scFv基因和apcA基因的部分序列。
[0041] 2.重组质粒的构建
[0042] 以scFv、linker和apcA为模板,用引物scFvF和引物9311apcAR,通过融合PCR 扩增,获得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后,利用BamHI和SacI双酶切,同时 把载体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体,然后以 5:1的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转 化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0043] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切,pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切,分别cpcS片段和载体片段回收后,以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克 隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0044] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切,pRSFDuet-Ι载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种,构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0045] 人工合成的基因 pebS和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切,分别回收pebS基 因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接,16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠 杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆 用于保种,构建成功的质粒pRSF-Hol-pebS用于后续实验。
[0046] 3.重组菌株的构建与筛选
[0047] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3),转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上,37°C过夜培养后。挑取20个克隆,分别接种 于3mL LB培养基(培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素)中,37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物,转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中,37°C,200RPM条件下培养 4小时,加入终浓度为ImM IPTG诱导,培养物置于18°C,150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体,菌体的颜色变为红色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞,利用收集上清,加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟,取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株,保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0048] 4.重组蛋白(scFv-apcA-PEB)的发酵与分离纯化
[0049] 吸取甘油种200 μ L,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中,37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C, 200RPM条件下培养4小时,加入终浓度为ImM IPTG,18°C条件下诱导16小时。
[0050] 离心收集菌体,将菌体悬浮于PBS溶液中,冰浴中超声破碎,破碎液于4°C, 8000rpm条件下离心20min,弃上清,收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl,口!18.0,10_31/1^-疏基乙醇,8111〇1凡尿素),用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解,4°C,6000rpm离心10min,收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中,将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液,用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析,每透析12h倒去1/2体积的透析液,加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析,48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中,4°C,1000 Orpm 离心10min,收集上清液。上清样品过结合缓冲液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑,pH 7. 4)平衡好的镍柱,再用洗涤液洗涤(500mmol/L 似(:1,15.5臟〇1/1似2册04,4.5臟〇1/1似氏?04,50臟〇1/1咪唑,口!17.4)镍柱,待检测不到蛋 白信号时,用洗脱液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑,pH 7.4)进行洗脱,收集流出液,再过G25脱盐柱,除去蛋白样品中的咪唑,得到重组 蛋白溶液。
[0051] 5.重组蛋白(scFv-apcA-PEB)的光谱学性质和免疫活性
[0052] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定,测量结果见图1,重组蛋白的最大吸收峰为549. 5nm。荧光发射光谱采 用F-4500荧光分光光度计,荧光激发波长为500nm,扫描波长为500-600nm,荧光发射光谱 见图2,最大荧光发射波长为560nm。本实验结果说明,重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光 谱学性质。
[0053] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性,将AFP亲本单抗和不同比例的 scFv-apcA,加入包被AFP抗原的96孔酶标板,37°C孵育2h,PBST洗涤3次后加入HRP标记 的抗小鼠 IgG抗体50 μ L,37°C孵育2h,加底物显色15分钟后终止反应。测定A450值,设立 加 PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照,每个浓度设3个复孔,方法同上。竞争抑制率(% ) =(A450亲本单抗-A450scFv-apcAV(A450亲本单抗-A450空白)。竞争性抑制试验结果 见图3,结果显示融合蛋白具有免疫学活性。
[0054] 表1 PCR扩增中使用的特异引物

[0057] 实施例2
[0058] 1.基因的克隆
[0059] 从美国国立生物信息中心(National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取 Synechocytissp. PCC 6803 apcA,Synechocytissp. PCC 6803 Hol,Prochlorococcus phage P-SSM2 pebS,Synechococcus elongatus BP-1 cpcS和 AFP单链抗体scFv基因序列(Accession No. AGQ46838)。由此分别设计扩增apcA,Hol,cpcS 和scFv基因的特异引物(表1)。apcA基因以Synechocytissp. PCC 6803基因组DNA为模 板,Hol 以 Synechocytissp. PCC 6803 基因组DNA为模板,cpcS 以 Synechococcus elongatus BP-I基因组DNA为模板,按常规PCR条件扩增获得。pebS、scFv基因和linker序列由南京 金斯瑞生物科技有限公司人工合成。为了便于融合PCR反应,linker序列人工合成过程中, 在其5'端和3'端分别加上scFv基因和apcA基因的部分序列。
[0060] 2.重组质粒的构建
[0061] 以scFv、linker和apcA为模板,用引物scFvF和6803apcAR,通过融合PCR扩 增,获得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后,利用BamHI和SacI双酶切,同时 把载体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体,然后以 5:1的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转 化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0062] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切,pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切,分别cpcS片段和载体片段回收后,以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克 隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0063] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切,pRSFDuet-Ι载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种,构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0064] 人工合成的基因 pebS和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切,分别回收pebS基 因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接,16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠 杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆 用于保种,构建成功的质粒pRSF-Hol-pebS用于后续实验。
[0065] 3.重组菌株的构建与筛选
[0066] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3),转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上,37°C过夜培养后。挑取20个克隆,分别接种 于3mL LB培养基(培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素)中,37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物,转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中,37°C,200RPM条件下培养 4小时,加入终浓度为ImM IPTG诱导,培养物置于18°C,150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体,菌体的颜色变为红色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞,利用收集上清,加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟,取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株,保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0067] 4.重组蛋白(scFv-apcA-PEB)的发酵与分离纯化
[0068] 吸取甘油种200 μ L,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中,37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C, 200RPM条件下培养4小时,加入终浓度为ImM IPTG,18°C条件下诱导16小时。
[0069] 离心收集菌体,将菌体悬浮于PBS溶液中,冰浴中超声破碎,破碎液于4°C, 8000rpm条件下离心20min,弃上清,收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl,口!18.0,10_31/1^-疏基乙醇,8111〇1凡尿素),用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解,4°C,6000rpm离心10min,收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中,将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液,用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析,每透析12h倒去1/2体积的透析液,加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析,48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中,4°C,1000 Orpm 离心10min,收集上清液。上清样品过结合缓冲液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑,pH 7. 4)平衡好的镍柱,再用洗涤液洗涤(500mmol/L NaCl,15.5mmol/L Na2HP04,4.5mmol/L NaH2PO4, 50mmol/L咪唑,pH 7.4)镍柱,待检测不到蛋 白信号时,用洗脱液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑,pH 7.4)进行洗脱,收集流出液,再过G25脱盐柱,除去蛋白样品中的咪唑,得到重组 蛋白溶液。
[0070] 5.重组蛋白(scFv-apcA-PEB)的光谱学性质和免疫活性
[0071] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定,测量结果见图1,重组蛋白的最大吸收峰为549. 5nm。荧光发射光谱采 用F-4500荧光分光光度计,荧光激发波长为500nm,扫描波长为500-600nm,荧光发射光谱 见图2,最大荧光发射波长为560nm。本实验结果说明,重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光 谱学性质。
[0072] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性,将AFP亲本单抗和不同比例的 scFv-apcA,加入包被AFP抗原的96孔酶标板,37°C孵育2h,PBST洗涤3次后加入HRP标记 的抗小鼠 IgG抗体50 μ L,37°C孵育2h,加底物显色15分钟后终止反应。测定A450值,设立 加 PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照,每个浓度设3个复孔,方法同上。竞争抑制率(% ) =(A450亲本单抗-A450scFv-apcAV(A450亲本单抗-A450空白)。竞争性抑制试验结果 见图3,结果显示融合蛋白具有免疫学活性。
[0073] 实施例3
[0074] L基因的克隆
[0075] 从美国国立生物信息中心(National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取 Synechococcus elongatus BP-I apcA, Synechocytissp. PCC 6803 HoljProchlorococcus phage P-SSM2 pebS, Synechococcus elongatus BP-I cpcS和AFP单链抗体scFv基因序列(Accession No. AGQ46838)。由此分别设计扩增 apcA,Hol,cpcS 和 scFv 基因的特异引物(表 1)。apcA 基因以 Synechococcus elongatus BP-I基因组DNA为模板,Hol以Synechocytissp. PCC 6803基因组DNA为模板,cpcS以 Synechococcus elongatus BP-1基因组DNA为模板,按常规PCR条件扩增获得。pebS、scFv 基因和linker序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。为了便于融合PCR反应, linker序列人工合成过程中,在其5'端和3'端分别加上scFv基因和apcA基因的部分序 列。
[0076] 2.重组质粒的构建
[0077] 以scFv、linker和apcA为模板,用scFvF和BPapcAR下游引物,通过融合PCR扩 增,获得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后,利用BamHI和SacI双酶切,同时 把载体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体,然后以 5:1的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转 化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0078] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切,pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切,分别cpcS片段和载体片段回收后,以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克 隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0079] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切,pRSFDuet-1载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种,构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0080] 人工合成的基因 pebS和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切,分别回收pebS基 因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接,16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠 杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆 用于保种,构建成功的质粒pRSF-Hol-pebS用于后续实验。
[0081] 3.重组菌株的构建与筛选
[0082] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3),转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上,37°C过夜培养后。挑取20个克隆,分别接种 于3mL LB培养基(培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素)中,37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物,转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中,37°C,200RPM条件下培养 4小时,加入终浓度为ImM IPTG诱导,培养物置于18°C,150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体,菌体的颜色变为红色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞,利用收集上清,加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟,取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株,保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0083] 4.重组蛋白(scFv-apcA-PEB)的发酵与分离纯化
[0084] 吸取甘油种200 μ L,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中,37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C, 200RPM条件下培养4小时,加入终浓度为ImM IPTG,18°C条件下诱导16小时。
[0085] 离心收集菌体,将菌体悬浮于PBS溶液中,冰浴中超声破碎,破碎液于4°C, 8000rpm条件下离心20min,弃上清,收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl,口!18.0,10_31/1^-疏基乙醇,8111〇1凡尿素),用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解,4°C,6000rpm离心10min,收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中,将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液,用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析,每透析12h倒去1/2体积的透析液,加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析,48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中,4°C,1000 Orpm 离心10min,收集上清液。上清样品过结合缓冲液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑,pH 7. 4)平衡好的镍柱,再用洗涤液洗涤(500mmol/L 似(:1,15.5臟〇1/1似2册04,4.5臟〇1/1似氏?04,50臟〇1/1咪唑,口!17.4)镍柱,待检测不到蛋 白信号时,用洗脱液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑,pH 7.4)进行洗脱,收集流出液,再过G25脱盐柱,除去蛋白样品中的咪唑,得到重组 蛋白溶液。
[0086] 5.重组蛋白(scFv-apcA-PEB)的光谱学性质和免疫活性
[0087] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定,测量结果见图1,重组蛋白的最大吸收峰为549. 5nm。荧光发射光谱采 用F-4500荧光分光光度计,荧光激发波长为500nm,扫描波长为500-600nm,荧光发射光谱 见图2,最大荧光发射波长为560nm。本实验结果说明,重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光 谱学性质。
[0088] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性,将AFP亲本单抗和不同比例的 scFv-apcA,加入包被AFP抗原的96孔酶标板,37°C孵育2h,PBST洗涤3次后加入HRP标记 的抗小鼠 IgG抗体50 μ L,37°C孵育2h,加底物显色15分钟后终止反应。测定A450值,设立 加 PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照,每个浓度设3个复孔,方法同上。竞争抑制率(% ) =(A450亲本单抗-A450scFv-apcAV(A450亲本单抗-A450空白)。竞争性抑制试验结果 见图3,结果显示融合蛋白具有免疫学活性。
[0089] 实施例4
[0090] 1.基因的克隆
[0091] 从美国国立生物信息中心(National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取Synechococcus CC9311 apcA,Synechocytis sp. PCC 6803 Hol, Synechocytis sp. PCC 6803 pcyA, Synechococcus elongatus BP-I cpcS 和 AFP 单链 抗体 scFv 基因序列(Accession No. AGQ46838)。由此分别设计扩增 apcA,Hol,pcyA,cpcS 和scFv基因的特异引物(表1)。apcA基因以Synechococcus CC9311基因组DNA为模板, Hol 和 pcyA 基因以 Synechocytis sp. PCC 6803 基因组 DNA 为模板,cpcS 以 Synechococcus elongatus BP-I基因组DNA为模板,按常规PCR条件扩增获得。scFv基因和linker序列 由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。为了便于基因片段的融合,linker序列人工合 成过程中,在其5'端和3'端分别加上scFv基因和apcA基因的部分序列。
[0092] 2.重组质粒的构建
[0093] 以scFv、linker和apcA为模板,用scFvF和9311apcAR下游引物,通过融合PCR 扩增,获得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后,利用BamHI和SacI双酶切,同时 把载体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体,然后以 5:1的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转 化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0094] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切,pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切,分别cpcS片段和载体片段回收后,以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克 隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0095] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切,pRSFDuet-Ι载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种,构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0096] pcyA基因片段和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切,分别回收pcyA基因片 段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接,16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆用于 保种,构建成功的质粒pRSF-Hol-pcyA用于后续实验。
[0097] 3.重组菌株的构建与筛选
[0098] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3),转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上,37°C过夜培养后。挑取20个克隆,分别接种 于3mL LB培养基(培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素)中,37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物,转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中,37°C,200RPM条件下培养 4小时,加入终浓度为ImM IPTG诱导,培养物置于18°C,150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体,菌体的颜色变为蓝色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞,利用收集上清,加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟,取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株,保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0099] 4.重组蛋白(scFv-apcA-PCB)的发酵与分离纯化
[0100] 吸取甘油种200 μ L,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中,37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C, 200RPM条件下培养4小时,加入终浓度为ImM IPTG,18°C条件下诱导16小时。
[0101] 离心收集菌体,将菌体悬浮于PBS溶液中,冰浴中超声破碎,破碎液于4°C, 8000rpm条件下离心20min,弃上清,收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl,口!18.0,10_31/1^-疏基乙醇,8111〇1凡尿素),用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解,4°C,6000rpm离心10min,收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中,将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液,用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析,每透析12h倒去1/2体积的透析液,加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析,48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中,4°C,1000 Orpm 离心10min,收集上清液。上清样品过结合缓冲液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑,pH 7. 4)平衡好的镍柱,再用洗涤液洗涤(500mmol/L 似(:1,15.5臟〇1/1似2册04,4.5臟〇1/1似氏?04,50臟〇1/1咪唑,口!17.4)镍柱,待检测不到蛋 白信号时,用洗脱液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑,pH 7.4)进行洗脱,收集流出液,再过G25脱盐柱,除去蛋白样品中的咪唑,得到重组 蛋白溶液。
[0102] 5.重组蛋白(scFv-apcA-PCB)的光谱学性质和免疫活性
[0103] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定,测量结果见图4,重组蛋白的最大吸收峰为614nm。荧光发射光谱采用 F-4500荧光分光光度计,荧光激发波长为580nm,扫描波长为600-700nm,荧光发射光谱见 图5,最大荧光发射波长为643nm。本实验结果说明,重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光谱 学性质。
[0104] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性,将AFP亲本单抗和不同比例的 scFv-apcA,加入包被AFP抗原的96孔酶标板,37°C孵育2h,PBST洗涤3次后加入HRP标记 的抗小鼠 IgG抗体50 μ L,37°C孵育2h,加底物显色15分钟后终止反应。测定A450值,设立 加 PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照,每个浓度设3个复孔,方法同上。竞争抑制率(% ) =(A450亲本单抗-A450scFv-apcAV(A450亲本单抗-A450空白)。竞争性抑制试验结果 见图6,结果显示融合蛋白具有免疫学活性。
[0105] 实施例5
[0106] 1.基因的克隆
[0107] 从美国国立生物信息中心(National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取 Synechocytis sp. PCC 6803 apcA,Synechocytis sp. PCC 6803 Hol, Synechocytis sp. PCC 6803 pcyA, Synechococcus elongatus BP-I cpcS和AFP 单链抗体scFv基因序列(Accession No. AGQ46838)。由此分别设计扩增apcA,Hol,pcyA, cpcS 和 scFv 基因的特异引物(表 1)。apcA,Hol 和 pcyA 基因以 Synechocytis sp.PCC 6803基因组DNA为模板,cpcS以Synechococcus elongatus BP-1基因组DNA为模板,按常 规PCR条件扩增获得。scFv基因和linker序列由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。 为了便于基因片段的融合,linker序列人工合成过程中,在其5'端和3'端分别加上scFv 基因和apcA基因的部分序列。
[0108] 2.重组质粒的构建
[0109] 以scFv、linker和apcA为模板,用引物scFvF和6803apcAR下游引物,通过融合 PCR扩增,获得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后,利用BamHI和SacI双酶切, 同时把载体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体,然后 以5:1的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转 化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0110] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切,pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切,分别cpcS片段和载体片段回收后,以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克 隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0111] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切,PRSFDuet-I载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种,构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0112] pcyA基因片段和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切,分别回收pcyA基因片 段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接,16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌 ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆用于 保种,构建成功的质粒pRSF-Hol-pcyA用于后续实验。
[0113] 3.重组菌株的构建与筛选
[0114] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3),转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上,37°C过夜培养后。挑取20个克隆,分别接种 于3mL LB培养基(培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素)中,37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物,转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中,37°C,200RPM条件下培养 4小时,加入终浓度为ImM IPTG诱导,培养物置于18°C,150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体,菌体的颜色变为蓝色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞,利用收集上清,加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟,取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株,保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0115] 4.重组蛋白(scFv-apcA-PCB)的发酵与分离纯化
[0116] 吸取甘油种200 μ L,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中,37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C, 200RPM条件下培养4小时,加入终浓度为ImM IPTG,18°C条件下诱导16小时。
[0117] 离心收集菌体,将菌体悬浮于PBS溶液中,冰浴中超声破碎,破碎液于4 °C, 8000rpm条件下离心20min,弃上清,收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl,口!18.0,10_31/1^-疏基乙醇,8111〇1凡尿素),用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解,4°C,6000rpm离心10min,收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中,将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液,用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析,每透析12h倒去1/2体积的透析液,加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析,48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中,4°C,1000 Orpm 离心10min,收集上清液。上清样品过结合缓冲液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑,pH 7. 4)平衡好的镍柱,再用洗涤液洗涤(500mmol/L 似(:1,15.5臟〇1/1似2册04,4.5臟〇1/1似氏?04,50臟〇1/1咪唑,口!17.4)镍柱,待检测不到蛋 白信号时,用洗脱液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑,pH 7.4)进行洗脱,收集流出液,再过G25脱盐柱,除去蛋白样品中的咪唑,得到重组 蛋白溶液。
[0118] 5.重组蛋白(scFv-apcA-PCB)的光谱学性质和免疫活性
[0119] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定,测量结果见图4,重组蛋白的最大吸收峰为614nm。荧光发射光谱采用 F-4500荧光分光光度计,荧光激发波长为580nm,扫描波长为600-700nm,荧光发射光谱见 图5,最大荧光发射波长为643nm。本实验结果说明,重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光谱 学性质。
[0120] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性,将AFP亲本单抗和不同比例的 scFv-apcA,加入包被AFP抗原的96孔酶标板,37°C孵育2h,PBST洗涤3次后加入HRP标记 的抗小鼠 IgG抗体50 μ L,37°C孵育2h,加底物显色15分钟后终止反应。测定A450值,设立 加 PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照,每个浓度设3个复孔,方法同上。竞争抑制率(% ) =(A450亲本单抗-A450scFv-apcAV(A450亲本单抗-A450空白)。竞争性抑制试验结果 见图6,结果显示融合蛋白具有免疫学活性。
[0121] 实施例6
[0122] 1.基因的克隆
[0123] 从美国国立生物信息中心(National Centre for Biotechnology Information, NCBI)数据库获取 Synechococcus elongatus BP-I apcA, Synechocytis sp. PCC 6803 HoljSynechocytis sp. PCC 6803 pcyA,Synechococcus elongatus BP-I cpcS和AFP单链抗体scFv基因序列(Accession No. AGQ46838)。由此分别设计扩增apcA, Hol,pcyA,cpcS 和 scFv 基因的特异引物(表 1)。apcA 和 cpcS 基因以 Synechococcus elongatus BP-1 基因组 DNA 为模板,Hol 和 pcyA 基因以 Synechocytis sp. PCC 6803 基因 组DNA为模板,按常规PCR条件扩增获得。scFv基因和linker序列由南京金斯瑞生物科技 有限公司人工合成。为了便于基因片段的融合,linker序列人工合成过程中,在其5'端和 3'端分别加上scFv基因和apcA基因的部分序列。
[0124] 2.重组质粒的构建
[0125] 以scFv、linker和apcA为模板,用scFvF和BPapcAR,通过融合PCR扩增,获 得嵌合基因 scFv-apcA。scFv-apcA片段回收后,利用BamHI和SacI双酶切,同时把载 体pCDFDuet-Ι也利用相同的酶进行双酶切。分别回收嵌合基因片段和载体,然后以5:1 的摩尔比进行连接。16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化 平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的重组质粒 pCDF-scFv-apcA用于下一步实验。
[0126] 将扩增得到的cpcS基因回收后用BglII和Sail双酶切,pCDF-scFv-apcA利用 BglII和XhoI双酶切,分别cpcS片段和载体片段回收后,以5:1摩尔比连接。16°C条件下 连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克 隆送样测序。验证无误后保种,构建成功的质粒P⑶F-scFv-apcA-cpcS用于后续实验。
[0127] 将扩增得到Hol基因回收后用BglII和Sail双酶切,pRSFDuet-Ι载体用BglII和 XhoI双酶切。分别回收基因片段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接。16°C条件下连接过 夜后,将连接产物转化大肠杆菌ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样 测序。测序验证无误的克隆用于保种,构建成功的质粒PRSF-Hol用于后续实验。
[0128] pcyA基因片段和质粒pRSF-Hol均用NcoI和Sail酶切,分别回收pcyA基因片 段和载体片段,以5:1摩尔比进行连接,16°C条件下连接过夜后,将连接产物转化大肠杆菌 ToplO。从转化平板上挑取克隆做菌液PCR,阳性克隆送样测序。测序验证无误的克隆用于 保种,构建成功的质粒pRSF-Hol-pcyA用于后续实验。
[0129] 3.重组菌株的构建与筛选
[0130] 将上述构建好的质粒通过共转化导入大肠杆菌BL21 (DE3),转化后的大肠杆菌涂 布在含有卡那霉素和壮观霉素的LB平板上,37°C过夜培养后。挑取20个克隆,分别接种 于3mL LB培养基(培养基中含有抗生素卡那霉素和壮观霉素)中,37°C培养过夜。从中吸 取150 μ L的培养物,转接到含有相应抗生素的5mL LB培养基中,37°C,200RPM条件下培养 4小时,加入终浓度为ImM IPTG诱导,培养物置于18°C,150RPM继续培养16-20小时。离 心收集菌体,菌体的颜色变为蓝色。利用超声波细胞粉碎机破碎细胞,利用收集上清,加入 Loading Buffer后煮沸处理10分钟,取样进行SDS-PAGE电泳。选择重组蛋白表达量高的 菌株,保甘油种用于后续发酵与重组蛋白的分离纯化。
[0131] 4.重组蛋白(scFv-apcA-PCB)的发酵与分离纯化
[0132] 吸取甘油种200 μ L,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的LB培养基中,37°C过夜培 养后。吸取6mL过夜培养物,接种于含有卡那霉素和壮观霉素的300mL LB培养基中。37°C, 200RPM条件下培养4小时,加入终浓度为ImM IPTG,18°C条件下诱导16小时。
[0133] 离心收集菌体,将菌体悬浮于PBS溶液中,冰浴中超声破碎,破碎液于4°C, 8000rpm条件下离心20min,弃上清,收集包涵体。向包涵体中加入一定体积的变性液 (20mmol/L Tris-HCl,口!18.0,10_31/1^-疏基乙醇,8111〇1凡尿素),用磁力搅拌器4<€下 缓慢搅拌12h使沉淀缓慢溶解,4°C,6000rpm离心10min,收集复性液。将复性液倒入处理 过的透析袋中,将透析袋置于含4mol/L尿素的透析缓冲液,用磁力搅拌器4°C下缓慢搅拌 透析,每透析12h倒去1/2体积的透析液,加入1/2体积新鲜的无尿素的透析缓冲液继续透 析,48h后换PBS缓冲液平衡24h。复性完成后将透析液小心倒入离心管中,4°C,1000 Orpm 离心10min,收集上清液。上清样品过结合缓冲液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4, 4. 5mmol/L NaH2P04,20mmol/L咪唑,pH 7. 4)平衡好的镍柱,再用洗涤液洗涤(500mmol/L NaCl,15.5mmol/L Na2HP04,4.5mmol/L NaH2PO4, 50mmol/L咪唑,pH 7.4)镍柱,待检测不到蛋 白信号时,用洗脱液(500mmol/L NaCl,15. 5mmol/L Na2HPO4,4. 5mmol/L NaH2PO4, 500mmol/L 咪唑,pH 7.4)进行洗脱,收集流出液,再过G25脱盐柱,除去蛋白样品中的咪唑,得到重组 蛋白溶液。
[0134] 5.重组蛋白(scFv-apcA-PCB)的光谱学性质和免疫活性
[0135] 分别测定重组蛋白的吸收光谱和荧光发射光谱。吸收光谱采用UV1801分光光度 计室温条件下测定,测量结果见图4,重组蛋白的最大吸收峰为614nm。荧光发射光谱采用 F-4500荧光分光光度计,荧光激发波长为580nm,扫描波长为600-700nm,荧光发射光谱见 图5,最大荧光发射波长为643nm。本实验结果说明,重组蛋白具有与藻胆蛋白类似的光谱 学性质。
[0136] 采用竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性,将AFP亲本单抗和不同比例的 scFv-apcA,加入包被AFP抗原的96孔酶标板,37°C孵育2h,PBST洗涤3次后加入HRP标记 的抗小鼠 IgG抗体50 μ L,37°C孵育2h,加底物显色15分钟后终止反应。测定A450值,设立 加 PBS的AFP亲本单抗作为阳性对照,每个浓度设3个复孔,方法同上。竞争抑制率(% ) =(A450亲本单抗-A450scFv-apcAV(A450亲本单抗-A450空白)。竞争性抑制试验结果 见图6,结果显示融合蛋白具有免疫学活性。

1. 一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法,其特征在于:将AFP单链抗体基因和 别藻蓝蛋白a亚基基因通过linker序列拼接成嵌合基因,并将该嵌合基因、藻胆蛋白裂合 酶基因和藻胆色素生物合成酶基因在大肠杆菌中共表达,获得共价结合藻红胆素的融合荧 光蛋白质或共价结合藻蓝胆素的融合荧光蛋白。2. 按权利要求1所述的大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法,其特征在于:所述藻 胆色素为藻红胆素或藻蓝胆素。3. 按权利要求1所述的大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法,其特征在于: 1) 利用融合PCR,将AFP单链抗体基因,linker序列和别藻蓝蛋白亚基基因连接形成 嵌合基因,将该嵌合基因插入到大肠杆菌表达载体PCDFDuet-I的一个表达框中;将裂合酶 基因cpcS插入到该表达载体的另一个表达框中; 2) 将藻红胆素生物合成酶基因Hol和pebS,分别插入到另一个表达载体pRSFDuet-1 的两个表达框中; 3) 将两个构建好的表达载体同时转化大肠杆菌,得到重组大肠杆菌; 4) 将重组大肠杆菌进行发酵培养,IPTG诱导融合蛋白表达,通过复性和金属螯合亲和 层析纯化,得到共价结合藻红胆素的融合荧光蛋白质。4. 按权利要求1所述的大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法,其特征在于: 1) 利用融合PCR,将AFP单链抗体基因,linker序列和别藻蓝蛋白a亚基基因连接形 成嵌合基因,将该嵌合基因插入到大肠杆菌表达载体PCDFDuet-I的一个表达框中;将裂合 酶基因cpcS插入到该表达载体的另一个表达框中; 2) 将藻蓝胆素生物合成酶基因Hol和pcyA分别插入到另一个表达载体pRSFDuet-1的 两个表达框中; 3) 将两个构建好的表达载体同时转化大肠杆菌,筛选出同时表达上述多个基因的菌株 并能够生产融合荧光蛋白质的菌株,即得表达菌株; 4) 将表达菌株进行发酵培养,IPTG诱导融合蛋白表达,利用金属螯合亲和层析纯化, 从而得到共价结合藻蓝胆素的融合荧光蛋白质。5. 按权利要求3或4所述的大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法,其特征在于: linker序列是: GGATCCGCCGAAGCGGCCGCAAAAGAAGCTGCGGCCAAGGAAGCAGCTGCGAAAGAAGCCGCAGCTAAGGCGG AATTC0
本发明属于生物技术中荧光蛋白质和重组抗体领域,具体的说是涉及一种大肠杆菌中融合荧光蛋白质的制备方法。制备方法是将AFP单链抗体基因和别藻蓝蛋白α亚基基因通过linker序列拼接成嵌合基因,并将该嵌合基因、藻胆蛋白裂合酶基因和藻胆色素生物合成酶基因在大肠杆菌中共表达,获得共价结合藻红胆素的融合荧光蛋白质或共价结合藻蓝胆素的融合荧光蛋白。本发明是利用生物技术方法在大肠杆菌体内生产单链抗体和别藻蓝蛋白α亚基融合蛋白,是一种环境友好、成本低的制备方法。该融合蛋白可用于生物学和生物医学检测等领域。
C12N15/70, C12P21/02, C12N15/62
CN105018552
CN201510426302
陈华新, 武静, 姜鹏, 赵瑾
中国科学院海洋研究所
2015年11月4日
2015年7月20日

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