小白qPCR扫盲和2个超赞的在线引物设计网站介绍!

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实时荧光定量PCR引物设计

实时荧光定量PCR作为实验室最常用的实验。研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。

首先,实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

最常用的方法有SYBRGreenⅠTaqMan探针法。下面介绍一下原理:

1.

SYBRGreenⅠ法:

在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2.

TaqMan探针法:

探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;当PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。因此他每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

在进行实时荧光定量PCR引物设计之前,大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则.

下面介绍两个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站,不用安装软件,直接上网就可搞定。

Primerbank。

网址:https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

1.首先进入网站主页,选择Keyword, 根据自己需求选择种属以及基因名称。

2.点击 submit 后可以看到以下界面,网站会推荐多对引物,可以根据引物长度、Tm值选择。

Primer3plus。

网址;http:///cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

1. 在 PUBMED 获得基因序列后,在 primer3plus 主页上输入基因序列。

2. 点击general setting, 设置引物扩增长度,一般可设置扩增长度偏大一些,然后根据推荐引物选取合适扩增长度。

3. 点击pick primers后,首先会看到优选推荐的一对引物,同时在序列中看到引物所在位置。Primer3plus 网站中可以看到引物 Tm 值以及 GC含量。

设计好引物之后,

最好在NCBI的BLAST里检验一下引物的特异性,再交给公司合成。

1. 进入 pubmed 主页,点击 BLAST 中 Nucleotide Blast。

2. 选一条引物序列输入对话框,点击BLAST。

3. 网页打开后,会看到如下界面,不同颜色代表对引物序列的评分,一般会选择40分以上,即至少蓝色。继续下拉网页会看到序列详细信息,物种分类、基因名称以及序列位置。

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小白qPCR扫盲和2个超赞的在线引物设计网站介绍!的相关问答如下:

提问:为什么安装了Java软件,lamp的在线引物设计网站打开了,还是不能用

回答:可能是源程序有问题.建议重新下载安装看看.1.解压之后,启动安装程序.2.这里选择安装路径要注意,很多人安装在C盘都出现的使用一段时间之后无法使用的问题,所以小编建议换个磁盘进行存放.3.安装完成后,会出现一个项目保存路径,选择完成后勾上左下角那个勾,下次启动就不会出现.Java软件http://www.3322.cc/soft/5288.html

提问:为什么在线引物设计软件设计的引物在目标基因内找不到对应序列

回答:一般对于已知序列的PCR当然不要从保守序列来设计引物,只要从开放可读框前后开始设计就行了.需要从保守序列设计引物的情况一般是两种,一是某个物种里面某个特定基因序列从未被分离过,但其进化关系相近的物种有分离出这个基因的同源基因,这样我们可以调取这些同源基因,对比查看它们的保守序列设计引物,然后就利用这对引物就可以获得这个物种的这个基因的部分序列.然后再设计RACE获得全长序列.另外一种情况则是设计通用引物,很多情况下我们并不需要知道某些基因的全部信息,只要知道他有没有,这种时候就可以根据保守序列设计通用引物.这样的引物可以跨越很多物种获取同一个基因的信息,而不需要根据某特异的物种额外设计多种引物.(搬运过来的,希望对你有帮助)

提问:引物设计软件有哪些啊

回答:primer 5,primer 6 ,beacon design, primer express在线的有primer3还有一些小的不出名引物设计软件,perlprimer,甲基化引物设计软件methprimer(名字记得不是很清楚了)

提问: 求引物设计软件primer premier 5 破解版 谢谢啊 我邮箱chenyuan7911@163.com,谢谢了

回答:已发送,请查收,tobaby_hu@163.com

提问: 请问realtimePCR的引物怎么设计?

回答:我建议你下载一个primer express 的软件.做定量的引物比做普通PCR的引物要精细一些.用一般的引物设计软件其实不是特别合适.这个软件里面应该还附带说明书.不难学!如果你是用sybr,那么普通的设计软件也可以,但是尽量不要有二聚体!如果你是用taqman探针,我建议你用这个软件.

提问: 实时定量PCR引物设计

回答:1,PCR引物是利用碱基互补原则,通过找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列.2,首先要找到你用来设计引物的目的基因全序列,一般NCBI、...

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